研究small rna修饰的挑战与方法-凯发app

研究small rna修饰的挑战与方法

定性及定量分析small rna修饰是研究越来越重要的small rna表观转录组学的关键步骤。然而，直到最近，相关的方法学与技术手段还是较为贫乏，仅具有有限的分析能力。随着以微阵列技术为基础的方法创新，高通量、高灵敏度、高准确性和具有计算修饰化学计量能力的small rna谱分析现在可用于生物和临床研究实验室，以推进small rna表观转录组学的新研究和相关临床应用。

分析small rna修饰研究面临的挑战

虽然测序已被用于small rna表达分析，但是rna上的修饰对测序定量的影响目前其实被很大程度的忽略了。事实上，各种的rna修饰，如m1a、m3c、m1g等，在测序文库构建过程中会干扰逆转录反应，从而对small rna，特别是对small rna修饰的精确定量造成很大的干扰。例如，small rna-seq结果大多偏向于检测到18-nt的3 '-tsrna，而不是通过northern blot观察到的更主要的22-nt亚型。这是由于在tuc环上的m1a修饰阻碍了逆转录过程的进行。由于大多数small rna测序数据是通过上述文库构建方法获得的。因此，这些数据可能会对small rna修饰研究造成误导。

此外，通过small rna-seq进行的small rna分析需要经过多个pcr扩增步骤，这会导致测序结果显著的定量偏差以及不准确性，因此需要使用独立的、正交的方法进行相关研究。

在实践中，大多数基于测序的修饰研究方法需要大量的实验材料(> 100 µg总rna)，这使得许多只能获取有限样本量的实验无法开展。

更进一步的问题在于，small rna-seq通常使用rpm（每百万reads中来源于某一基因reads数）这一指标进行标准化，并以此表示样本中的相对rna丰度。然而，rpm取决于样本中small rna类群整体的组成情况。单个small rna的rpm变化会改变所有其他small rna的rpm值，即使它们实际的绝对表达水平没有改变。

综上所述，为了在高灵敏度、准确化学计量的标准下鉴定和量化修饰small rna谱，有必要开发测序非依赖的方法以克服基于测序方法的这些局限性。

对small rna转录后修饰的定量技术

arraystar small rna修饰芯片技术(图1)结合了small rna定量芯片以及rna免疫沉淀技术（rip），通过对同一微阵列上带有修饰以及不带修饰的small rna水平进行同时检测，为研究包括mirna，pre-mirna，tsrnas（trf以及tirna）在内的small rna修饰的调控作用提供了重要信息。

图1. arraystar small rna修饰芯片鉴定和定量small rna转录后修饰，检测的修饰包括o8g、m7g、m6a、ψ和m5c等。其原理主要是使用特异性抗体免疫沉淀富集修饰small rna，然后使用arraystar small rna修饰芯片对其进行鉴定和定量。

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