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基因芯片技术服务 small rna修饰芯片 m6a单碱基分辨率芯片 mrna&lncrna表观转录组芯片 circrna表观转录组芯片 |
ngs测序技术服务 rna m6a甲基化测序（merip seq） |
lc-ms mrna碱基修饰检测 trna碱基修饰检测 |
pcr技术服务 m6a绝对定量rt-pcr技术服务 m6a单碱基位点pcr（mazf酶切法）技术服务 |
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基因芯片技术服务 dna甲基化芯片 dna羟甲基化芯片 chip-chip |
ngs测序技术服务 dna甲酰基胞嘧啶(5fc)修饰测序 dna 5hmc 测序（化学法） dna甲基化测序 dna羟甲基化测序 染色质免疫共沉淀测序 |
pcr技术服务 medip-qpcr hmedip-qpcr chip-qpcr |
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蛋白相对定量 tmt标记定量技术 非标定量技术 |
蛋白修饰 tmt标记定量磷酸化 非标定量磷酸化 |
rna/蛋白-蛋白相互作用 rna-蛋白相互作用 蛋白-蛋白相互作用 |
实时荧光定量pcr技术是在普通pcr反应体系中加入荧光试剂，利用荧光信号实时检测pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量pcr能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度。trf & tirna是由trna切割产生，长度约15-45个核苷酸的小rna。由于trf & tirna长度太短，且与trna序列完全重叠，不能通过传统的实时定量pcr进行检测。本公司通过在trf & tirna两端引入人工合成序列（adaptor），设计特殊的跨连接位点的定量pcr引物，可以精确检测微量样品中trf & tirna表达水平。
aksomics（原康成生物）为您提供trf&tirna 实时定量pcr技术服务，您只需提供保存完好的组织或者细胞标本，本公司专业的技术服务人员就可替您完成trf&tirna实时定量pcr实验操作和数据分析，提供给您完整的实验报告，为您节省大量的时间和精力。
图1. 双端接头法保证了trf & tirna pcr产物的高特异性。
1. 引物设计、合成
设计并合成目的trf & tirna的特异性pcr引物。
2. 样品rna抽提
a. 若实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml的rna抽提试剂trizol（invitrogen），匀浆后抽提rna。
b. 若实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，完全吸去培养液后加1ml的rna抽提试剂trizol（invitrogen），裂解后抽提rna。
3. rna质量检测
a. 紫外吸收测定法测定rna在波长260nm和280nm的吸收值，获得rna的浓度并通过a260/280及a260/230的吸收比值判断rna的纯度。
b. 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测rna纯度和完整性。
注：用于trf & tirna实时定量pcr检测的rna样品，必须高纯度、完整，没有rnase 污染（降解的样品不能用于实时定量pcr检测），同时提取方法必须保证所得样品包含完整的小rna部分。
4.rna预处理（可选）
使用rtstar™ trf&tirna pretreatment kit (cat# as-fs-005, arraystar)进行预处理，去除3’氨酰基末端与3‘环磷酸末端，磷酸化5’羟基末端，并移去m1a, m3c等多种甲基化修饰。
注：trna上存在大量的转录后修饰，而且trna需与氨基酸形成氨酰基trna方可参与蛋白翻译。当trnas被切割为trfs&tirnas时，这些修饰（包括甲基化修饰、氨酰基末端修饰）会全部或部分的保留下来。tirnas常由rna内切酶angiogenin切割产生，这类内切酶会在切割位点产生5‘羟基（5’-oh）末端与3’环磷酸（3‘-cp）末端。然而，5’端与3‘端的接头连接步骤，需要底物小rna 5’ 端为磷酸，3‘端为羟基。此外，某些trfs&tirnas的内部修饰比如m1a, m1g与m3c会严重阻碍反转录过程。因此为了准确检测trfs&tirnas，这些修饰必须被有效的去除。
5. 逆转录合成cdna
使用rtstar™ first-strand cdna synthesis kit (3’ and 5’ adaptor) (cat# as-fs-003, arraystar) 试剂盒进行接头连接和反转,合成cdna第一链。
6. 实时定量pcr
以合成的cdna作为模板进行实时定量pcr扩增，梯度稀释的标准同时进行实时定量pcr扩增，根据ct值制备标准曲线。以同样的方法测定每个样品中的内参，校正上样误差。
7. 分析结果、提供实验报告
分析实时定量pcr结果，根据标准曲线定量样品中的目的trf & tirna。提供实验报告，包括详细的实验方法，实时定量pcr实验数据和图表。
