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基因芯片技术服务 m6a单碱基分辨率芯片 mrna&lncrna表观转录组芯片 circrna表观转录组芯片 |
ngs测序技术服务 rna m6a甲基化测序（merip seq） |
lc-ms mrna碱基修饰检测 trna碱基修饰检测 |
pcr技术服务 m6a绝对定量rt-pcr技术服务 m6a单碱基位点pcr（mazf酶切法）技术服务 |
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基因芯片技术服务 dna甲基化芯片 dna羟甲基化芯片 chip-chip |
ngs测序技术服务 dna甲基化测序 dna羟甲基化测序 染色质免疫共沉淀测序 |
pcr技术服务 medip-qpcr hmedip-qpcr chip-qpcr |
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蛋白相对定量 tmt标记定量技术 非标定量技术 |
蛋白修饰 tmt标记定量磷酸化 非标定量磷酸化 |
rna/蛋白-蛋白相互作用 rna-蛋白相互作用 蛋白-蛋白相互作用 |
作为基因组dna的直接产物，rna对生命活动有着至关重要的意义，是生命活动的又一执行者：1、参与蛋白质的合成；2、参与转录后修饰和dna修复；3、参与基因表达调控等。对于一种特定的rna（如，lncrna，mrna，circrna，microrna，trf&tirnas等），往往具有与之对应的相互作用蛋白共同执行特定的生理功能，以lncrna为例，近年来，lncrnas在基因表达调控方面的重要功能越来越被人们所关注，但它们的具体功能还有待阐明。lncrna可能通过4种作用机制参与基因调控：decoy，作为诱饵分子，替代蛋白与dna的相互作用；scaffold，作为骨架分子，为蛋白复合体提供空间支撑作用；guide，作为引导分子，介导蛋白-蛋白、蛋白dna/rna相互识别；enhancer，作为增强子类似组件，促进基因表达[1] 。运用rna亲和纯化技术（eg. chirp-ms，rap-ms[2]），构建特定rna相互作用蛋白谱，对阐明rna的生理病理机制至关重要。
图1. lncrna作用机制模型。
参考文献
1.rinn, j. l. & chang, h. y. genome regulation by long noncoding rnas. annual review of biochemistry 81, 145-166, doi:10.1146/annurev-biochem-051410-092902 (2012). [pmid: 22663078].
2.mchugh, c. a. et al. the xist lncrna interacts directly with sharp to silence transcription through hdac3. nature 521, 232-236, doi:10.1038/nature14443 (2015). [pmid: 25915022].
根据目标rna的尺寸大小，可采用两种相似的技术策略：
长链rna：例如，lncrna、circrna、mrna等常采用rna antisense purification – mass spectrometry策略。生物样品在非变性条件下裂解和uv交联，或者不裂解直接在原位进行uv交联，随后用biotin标记的rna anti-sense进行杂交（control组采用非特异anti-sense或预先用rnase处理）。
短链rna：例如，micorna、trf&tirna等通常采用rna affinity purification – mass spectrometry策略。体外合成biotin标记的目标rna（control组采用scramble rna），加入到非变性裂解的生物样品中，孵育替换内源的rna。
随后，通过固定化avidin对biotin进行pull-down，得到的rbp经lc-ms/ms鉴定和定量分析，与目标rna特异性相互作用的蛋白（a, b, c, d）在两组间具有显著差异，非特异相互作用蛋白（x）在两组间比例接近1：1。据此构建目标rna的相互作用蛋白谱。
图2.rap-ms技术原理和实验流程。
案例展示1
运用chirp-ms技术 (和rap-ms技术原理相同的技术，a)，stanford大学的科研人员对xist rna的相互作用蛋白谱进行了研究，发现81种xist rna相互作用蛋白，对xist的功能行使具有重要意义。[3]
首先，为了对chirp-ms方法进行验证，作者选择了两种已知的snrna，u1/u2（参与剪接体的组装）进行验证实验。u1/u2具有很高的表达量，同时，剪接体的组分研究得较为清楚，另外，u1/u2在抑制未成熟mrna的剪接和poly-a化方面的作用已见报道，预示着更多未知的相互作用蛋白可能被鉴定到，因此u1/u2很适用于chirp-ms方法验证。针对u1/u2设计anti-sense rna进行chirp-ms实验，结果如下：u1和u2分别富集了418和370个蛋白，其中113个已知的剪接体蛋白（共143个）(c)。
相互作用网络图进一步展示了u1/u2互作蛋白富集情况：位于上部的为已知蛋白，主要为剪接体蛋白，位于下方的为功能未知蛋白，包括只与u1或u2互作的蛋白以及和两者共同作用的蛋白。chirp-ms技术不仅能够很好的鉴定已知的rna互作蛋白，同时也能鉴定未知蛋白，是研究rna-protein相互作用的强大工具。
案例展示2
在多种应激条件下，trna能够发生特异性酶切，产生一类功能独特的trna片段（trfs），和许多生理病理过程密切相关。来自rockefeller university的科学家通过高通量测序技术发现一类trfs特异性高表达于高转移性乳腺癌细胞中，并具有特定的motif，据此推测，细胞中可能存在某些与之特异性识别的蛋白质。为了鉴定这些未知的相互作用蛋白，作者运用rna亲和纯化技术，用biotin标记的trfs片段进行pull down（短链rna rap-ms技术），结合lc-ms/ms鉴定和定量分析，发现一个潜在的结合蛋白ybx1，并进行了深入研究。结果表明，ybx1蛋白能够与肿瘤转移相关基因mrna结合并稳定mrna，而trfs可与mrna竞争性结合ybx1，进而使肿瘤转移相关的mrna去稳定性，抑制肿瘤的转移性。[4]
