实时荧光定量pcr技术是在普通pcr反应体系中加入荧光试剂，利用荧光信号实时检测pcr进程，避免了传统pcr以终产物检测定量产生的偏差，提高实验的重复性。绝对定量的实时荧光定量pcr是在实时荧光定量pcr时加入标准品通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。绝对定量的实时荧光定量pcr能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度，该技术已被广泛用于检测细胞mrna表达量的变化、比较不同组织的mrna表达差异、验证基因芯片和sirna干扰的实验结果。
康成生物丨数谱生物为您提供mrna&lncrna绝对定量实时定量pcr技术服务，您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，本公司专业的技术服务人员就可替您完成绝对定量的实时定量pcr实验操作和数据分析，提供给您完整的实验报告。
每微克 total rna target 1 rna拷贝数=x
如果细胞的数量为106，总rna为15ug，则每个细胞的target 1的拷贝数为：（x×15）/ 106
1. 引物设计、合成
设计并合成目的基因的特异性pcr引物。
2. 样品rna抽提
a. 若实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml的rna抽提试剂trizol（invitrogen），匀浆后抽提rna。
b. 若实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，完全吸去培养液后加1ml的rna抽提试剂trizol（invitrogen），裂解后抽提rna。
3. rna质量检测
a．紫外吸收测定法测定rna在波长260nm和280nm的吸收值，获得rna的浓度并通过a260/280及a260/230的吸收比值判断rna的纯度。
b．甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测rna纯度和完整性。
注：用于实时定量pcr检测的rna样品，必须高纯度、完整，没有rnase 污染（降解的样品不能用于实时定量pcr检测），同时提取方法必须保证所得样品包含完整的小rna部分。
4. 逆转录合成cdna
每个样品我们加入已知浓度的rna（rna spike-in）并使用rtstar™ first-strand cdna synthesis kit (cat# as-fs-001, arraystar) 试剂盒进行反转录,合成cdna第一链。
5. 实时定量pcr
在合成cdna第一链中加入标准品与cdna一同作为模板进行实时定量pcr扩增，，根据ct值制备标准曲线。
6. 分析结果、提供实验报告
各样品的目的基因和标准品分别进行realtime pcr反应。根据标准品绘制标准曲线，各样品目的基因和rna spike in的cdna拷贝数结果直接由机器生成。（每个样品的目的基因cdna拷贝数x rna spike in的rna拷贝数）除以rna spike in的cdna拷贝数，即为此样品此基因的校正后的rna拷贝数。
