当前的研究发现,很大一部分m6a修饰发生在含有核心aca序列的保守motif区域,通常称为是m6aca位点。康成生物丨数谱生物提供对rna上潜在m6aca位点进行检测或验证的技术服务——m6a单碱基位点pcr(mazf酶切法)。
rna内切酶mazf识别rna单链并在非甲基化的aca位点的5’端进行切割,而不能切割甲基化的m6aca位点(图1)。
图 1. mazf可以在非甲基化aca位点切割,而无法在甲基化m6aca位点发挥作用
将抽提的总rna样本分为两份,一份不加mazf处理,另一份加mazf处理后。然后通过实时定量pcr技术进行检测(图2)。最后,经过数据分析处理得到检测的样品中特定aca位点的m6a甲基化水平。
图2. m6aca位点pcr检测(mazf酶切法)实验原理
mrna&lncrna m6aca位点检测:rna m6aca位点预测→total rna提取&质检→一份mazf酶处理,一份不加mazf酶处理→反转录成cdna→目标m6aca位点pcr检测
circrna m6aca位点检测:rna m6aca位点预测→total rna提取&质检→rnase r消化线性rna,保留circrna→ 一份mazf酶处理,一份不加mazf酶处理→反转录成cdna→目标m6aca位点pcr检测
●对m6a单位点的相对定量检测
●对m6a位点高度敏感的核糖核酸内切酶mazf
●通过严格测试的特异性引物
样本类型:新鲜组织、细胞或total rna
样 本 量:
mrna&lncrna m6aca位点检测::≥2μg total rna或者能获得相应份量的组织细胞,最低浓度不低于50ng/μl。
circrna m6aca位点检测:≥10μg total rna或者能获得相应份量的组织细胞,最低浓度不低于50ng/μl。
样品质量:a260/a280为1.9~2.2;无基因组dna污染;rna无降解。
样本运输:rna样品使用rnaase-free离心管保存,封口膜封口后干冰运输;组织细胞样品rnaase-free冻存管保存,干冰或液氮运输。
m6aca位点pcr(mazf酶切法)可对单个m6aca修饰位点进行检测(以下为示例展示)。
sample |
mazf-(ct) |
mazf (ct) |
methylation ratio % |
1 |
22.970 |
23.354 |
76.611 |
2 |
22.968 |
23.854 |
54.101 |
3 |
22.980 |
24.774 |
28.856 |
4 |
23.033 |
27.340 |
5.051 |
5 |
23.006 |
28.308 |
2.535 |
6 |
23.008 |
30.821 |
0.452 |