当前的研究发现，很大一部分m6a修饰发生在含有核心aca序列的保守motif区域，通常称为是m6aca位点。康成生物丨数谱生物提供对rna上潜在m6aca位点进行检测或验证的技术服务——m6a单碱基位点pcr（mazf酶切法）。
rna内切酶mazf识别rna单链并在非甲基化的aca位点的5’端进行切割，而不能切割甲基化的m6aca位点(图1)。
图 1. mazf可以在非甲基化aca位点切割，而无法在甲基化m6aca位点发挥作用
将抽提的总rna样本分为两份，一份不加mazf处理，另一份加mazf处理后。然后通过实时定量pcr技术进行检测（图2）。最后，经过数据分析处理得到检测的样品中特定aca位点的m6a甲基化水平。
图2. m6aca位点pcr检测（mazf酶切法）实验原理
mrna&lncrna m6aca位点检测：rna m6aca位点预测→total rna提取&质检→一份mazf酶处理，一份不加mazf酶处理→反转录成cdna→目标m6aca位点pcr检测
circrna m6aca位点检测：rna m6aca位点预测→total rna提取&质检→rnase r消化线性rna，保留circrna→ 一份mazf酶处理，一份不加mazf酶处理→反转录成cdna→目标m6aca位点pcr检测
●对m6a单位点的相对定量检测
●对m6a位点高度敏感的核糖核酸内切酶mazf
●通过严格测试的特异性引物
样本类型：新鲜组织、细胞或total rna
样 本 量：
mrna&lncrna m6aca位点检测：：≥2μg total rna或者能获得相应份量的组织细胞，最低浓度不低于50ng/μl。
circrna m6aca位点检测：≥10μg total rna或者能获得相应份量的组织细胞，最低浓度不低于50ng/μl。
样品质量：a260/a280为1.9~2.2；无基因组dna污染；rna无降解。
样本运输：rna样品使用rnaase-free离心管保存，封口膜封口后干冰运输；组织细胞样品rnaase-free冻存管保存，干冰或液氮运输。
m6aca位点pcr（mazf酶切法）可对单个m6aca修饰位点进行检测（以下为示例展示）。
|
sample |
mazf-(ct) |
mazf (ct) |
methylation ratio % |
|
1 |
22.970 |
23.354 |
76.611 |
|
2 |
22.968 |
23.854 |
54.101 |
|
3 |
22.980 |
24.774 |
28.856 |
|
4 |
23.033 |
27.340 |
5.051 |
|
5 |
23.006 |
28.308 |
2.535 |
|
6 |
23.008 |
30.821 |
0.452 |
