dna羟甲基化是一种重要的表观遗传修饰，对基因的表达起调控作用，在神经分化和癌症中发挥重要的作用。为深入了解5hmc的作用，我们就必须清楚5hmc在基因组的分布情况。然而，传统的基于重亚硫酸盐的方法无法区分5-hmc和5-mc。5-hmc单克隆抗体捕获法是研究dna羟基化修饰的利器，结合高通量测序技术以及生物信息分析，可以获得全基因组羟甲基化分布图，从而能帮助我们从一个新的角度来解析胚胎发育，神经细胞分化以及癌症发生的分子机制。
康成生物为您提供羟甲基化测序技术服务，您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，康成的技术服务人员就可为您完成全部实验操作，包括超声打断基因组、羟甲基化dna免疫共沉淀、hmedip与 input dna文库构建、高通量测序和数据分析、并提供完整的实验报告。
1. 羟甲基化峰识别：通过macs软件，可以利用与基因组匹配的read来识别羟甲基化峰，常用的macs筛选参数：fdr<0.01。
全基因组羟甲基化谱数据列表
1. 识别差异羟甲基化基因
通过macs软件，康成生物对不同样品或样品组间的基因启动子区域的差异羟甲基化进行了分析。为了对羟甲基化水平进行定量分析，处理组和对照组的样品分别通过相应的input样品进行标准化。根据处理组样品羟甲基化水平相对对照组的上下调情况，这些在启动子区域差异羟甲基化的基因被分成了“重新羟甲基化”（de novo methylation）和“去羟甲基化”（de-methylation）基因。
去羟甲基化的基因
超羟甲基化的基因
上图：黑色素瘤细胞中关键基因发生羟甲基化水平变化。a：ucsc可视化结果展示。黑色素瘤和痣组织相比整体羟甲基化水平减低，羟甲基化水平不变。b：对黑色素瘤和痣组织中检测到的dna羟甲基化位点和羟甲基化位点进行分类统计。黑色素瘤与痣组织相比，在启动子，外显子，内含子，基因间等区域羟甲基化水平下降，羟甲基化水平基本不变。 c: 基因内部（gene body）及周边(向两端各延伸20%)区段内的羟甲基化和羟甲基化reads（读段）密度分布。可以看到在黑色素瘤中，gene body 内羟甲基化水平降低。e: 韦恩图显示癌组织中在gene body区域羟甲基化水平降低同时羟甲基化水平升高的基因有2，144个。对这些基因进行pathway分析，发现变化的基因主要聚集在癌症相关的信号通路中。f： ucsc可视化结果展示，在rac3, igf1r, timp2中羟甲基化水平降低，羟甲基化水平升高。 g：hmedip-pcr对rac3，igf1r，timp2进行验证，证明在黑色素瘤中这些基因的羟甲基化水平降低，验证了测序的结果。
上图：过表达tet2后部分关键基因的羟甲基化水平得到恢复。构建tet2过表达的黑素素瘤细胞系，同时构建tet突变的细胞系作为对照。通过hmedip-seq检测，发现过表达tet2的细胞vs对照细胞 80%(12，752/15835)的羟甲基化升高的位点与黑色素瘤组织vs痣组织羟甲基化水平降低的位点重叠。将重叠的位点按照与基因的相对位置分成启动子和gene body两个部分，分别进行go和pathway分析。启动子重叠的基因聚集在信号传导，tgf-beta等重要的功能分类中；gene body重叠的基因集中在mapk， 细胞黏附等重要的通路中。
