exiqon mircury lna™ universal rt microrna pcr芯片检测平台，基于lna™专利技术，采用独特的universal rt反应，实现对microrna的准确定量检测，即使在总rna含量较低的样本，如ffpe和血清/血浆中，也可以获得高质量的microrna检测结果。
数谱生物为您提供exiqon公司mircury lna™ universal rt microrna pcr芯片——microrna实时定量pcr芯片技术服务，全部实验皆使用进口试剂完成，使用的定量pcr仪器为美国应用生物系统公司生产的荧光定量pcr仪abi prism® 7700或abi prism® 7900。pcr芯片技术服务的主要流程包括：抽提、rna质量检测、cdna模板制备、实时定量pcr、数据处理及制作实验报告。
exiqon mircury lna™ universal rt microrna pcr芯片列表
| 芯片名称 | 规格 | 物种 | 描述 |
|---|---|---|---|
| microrna ready-to-use pcr, human panel i | 384 well | 人 | 372个常见的人类mirna |
| microrna ready-to-use pcr, human panel i ii | 384 well | 人 | 752 个人类mirna |
| microrna ready-to-use pcr, mouse&rat panel i | 384 well | 小鼠，大鼠 | 372个常见的小鼠/大鼠mirna |
| microrna ready-to-use pcr, mouse&rat panel i ii | 384 well | 小鼠，大鼠 | 752 个小鼠/大鼠mirna |
| cancer focus microrna pcr panel | 96 well | 人 | 84个癌症相关的mirna |
| serum/plasma focus microrna pcr panel | 384 well | 人 | 179个在血清、血浆样品中验证过的mirna |
| stem cell focus microrna pcr panel | 96 well | 人 | 85个与胚胎干细胞或多能诱导干细胞相关的mirna |
exiqon的lna™专利技术攻破microrna pcr检测的两大难题
1. lna™化学修饰提高引物和靶标分子的结合力，提高检测灵敏度，解决microrna引物设计的难点：
microrna长度仅22nt左右，相当于一条普通oligo引物的长度，而pcr扩增需要上下游两条引物，因此传统的microrna的pcr方法仅一条引物为microrna特异性，另一条采用通用引物，检测的特异性降低。 此外，microrna的gc含量分布范围广: 5%-95%，由于a :t配对碱基的结合力要低于g :c配对，此gc含量低于50%的microrna,即使整条序列都被一条普通的oligo引物覆盖，该引物的tm值参数仍然难以达到pcr检测的要求（55-63℃），这个部分的microrna用普通引物是不能得到有效扩增。lna™专利技术能解决microrna研究的难点，包括pcr检测。每个lna™修饰位点能够提高引物tm值3-8℃，因此在相同的pcr反应条件下（引物的tm值60℃左右），可以通过加入lna™缩短引物的长度，使得上下游都为microrna特异性引物，pcr的特异性得到双重保障。而且更为重要的是，gc含量低的microrna的pcr问题也能迎刃而解，控制加入lna™的比例(gc含量低的microrna检测引物加入多个lna™修饰的碱基)，使所有的microrna都能得到有效的、均一的检测信号。
图1.左图为lna™（locked nucleic acid）的化学结构，lna是一种类寡核苷酸衍生物，提高引物和靶标分子的稳定性，能够增加引物的溶解温度（tm值）。相同的tm参数条件下，加入lna可以缩短引物长度（右图）。
2. lna™专利技术显著提高pcr反应的单碱基分辨能力，区分microrna家族各成员:
microrna中存在多个家族（microrna family）,家族成员间序列相似性极高，个别成员间仅相差一个碱基。普通oligo引物无法分辨单碱基差异，即使有一个碱基错配也能继续pcr反应，因此无法分辨极度相似的家族成员。lna™修饰的引物具有单碱基分辨能力，其原理如下图所示。δtm=tm(引物/完美匹配的靶标分子)-tm（引物/单碱基错配靶标分子），加入lna™后δtm值显著增加,pcr交叉反应的可能性大大降低。tm(lna引物/单碱基错配)低于pcr反应温度，pcr反应条件下引物和错配分子处于解离单链状态不能进行pcr反应；tm(lna引物/完美匹配靶标分子)高于60℃，产生有效的pcr扩增信号。
图2.左图加入lna™后δtm值显著增加,pcr交叉反应的可能性大大降低。右图，人工合成序列相似的microrna成员分子，用mircury lna™ universal rt microrna pcr平台检测。如表所示，交叉反应的信号极低，有些情况下甚至没有。
exiqon mircury lna™ universal rt microrna pcr芯片特点
1.灵敏度高：
微量样本，无需预扩增，节省宝贵样本；对rna量低的样本，如血清、血浆、ffpe、lcm等特殊样本尤其适用；lna™ pcr系统检测单个microrna仅需1pg总rna（图3）；而mircury lna™ universal rt microrna pcr芯片在仅仅40ng总rna中就可以检测730种microrna的表达；lnatm pcr芯片灵敏度是同类芯片的10倍以上。
2.特异性强：
经lnatm 优化的pcr引物，可有效区分microrna间的单碱基差异，并能区分成熟和前体microrna；同时使背景信号值最小；
3.准确性高：
lnatm pcr芯片上的引物均经过了实验验证；反转录采用universal rt对各种不同的microrna同时进行反转录，减少技术误差；对at含量高的microrna同样有效。
4.质控严格：
每个panel均包含6个内参和2组质控对照；基于sybr green的pcr方法，还可以提供溶解曲线以判断扩增特异性（图4）
5.高重复性：
简化实验步骤，减少技术误差，实验重复性好（图5）
exiqon mircury lna™ universal rt microrna pcr 芯片如何实现高通量高质量的microrna定量检测？
1.独特的universal rt反应：
一次单链cdna合成反应制备的cdna可作为芯片所有microrna pcr反应的模板（图6），减少操作步骤，消除技术误差，节省宝贵样本。同时避免了在芯片中使用混合rt引物对扩增特异性的影响。
图6. universal rt microrna pcr反应原理
2.基于lna™专利技术的pcr扩增反应：
实现引物tm值均一，并同时保持microrna扩增的高特异性和高灵敏度：
mircury lna™ universal rt microrna pcr芯片中所使用的microrna特异性的pcr引物（pcr扩增上下游引物）都经过lna™优化，并且经过严格的验证，能有效区分序列只差一个碱基的microrna，并能区别成熟microrna和microrna前体，从而保证对靶microrna的特异性扩增；同时，显著降低背景信号，从而增强对低丰度microrna的准确检测。
3.严格的芯片内参照和质控设置：
mircury lna™ universal rt microrna pcr芯片内设置了6个内参，包括：3个microrna (hsa-mir-103, hsa-mir-191 and hsa-mir-423-5p)，3个小rna (u6, snord38b and snord49a)。这些内参在大量实验结果和多种组织的microrna表达分析中均呈现出稳定的表达水平，但研究者也需要根据组织或细胞的实际情况选择最合适的、稳定表达的内参分析试验结果。
同时，芯片内还设置了一个spike-in对照和一组3次重复的芯片间误差校正参照。
exiqon mircury lna™ universal rt microrna pcr芯片应用
1. mircury lna™ universal rt microrna pcr芯片在lcm微量样本microrna表达检测中的应用：
由于mircury lna™ universal rt microrna pcr芯片要求的样本量较其他平台更少，对于lcm等微量样本尤其适用。（图7）
2. mircury lna™ universal rt microrna pcr芯片在血清/血浆的microrna检测中的应用：
近年来，microrna成为来源于血液来源的新生物学标记物，但由于采血量和microrna分子大小及表达水平等限制，检测血液中的microrna面临着诸多挑战。
mircury lna™ universal rt microrna pcr芯片具有无与伦比的灵敏度和检测特异性，即使对血清/血浆等含微量总rna的样本，也可实现对microrna的高质量检测；并且无需对cdna进行预扩增。（图8）
1.样品rna抽提
a.实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，使用biopulverizertm冰冻粉碎组织，加1ml的rna抽提试剂trizol（invitrogen），使用mini-bead-beater-16匀浆后抽提rna。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，加1ml的rna抽提试剂trizol（样品为贴壁细胞，每10cm2培养皿trizol使用量为1ml），裂解后抽提rna。
2.rna质量检测
a.使用nanodrop测定rna在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。
b.用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测rna纯度及完整性。
c.提供rna qc报告。
3.cdna合成
按照exiqon逆转录试剂盒使用说明将样品rna逆转录为cdna。
4.实时定量pcr
按照芯片说明将cdna模板适当稀释后加入到实时定量pcr反应混合液中，然后再含有基因特异性引物的96孔板各孔中加入等量反应液，进行实时定量pcr反应。
5.数据分析
利用配套软件计算pcr芯片中的各个mirna的ct值，采用公认的ddct方法比较基因的表达变化。
a.计算每个处理组中的每个mirna δct。
δct (ctrl) = average ct – average of hk genes’ ct for ctrl array
δct (exp) = average ct – average of hk genes’ ct for exp array
b.计算2个pcr array中每个基因的δδct。
δδct = δct (exp) - δct (ctrl)
c.通过2-δδct计算exp（实验组）与ctrl（对照组）间基因的表达差异。
6.提供实验报告
mirna table（mirna列表）
excel芯片结果汇总表（包括芯片原始结果、数据分析和各种图表）
1.分子标志物筛选
结肠癌分型marker(identification of serum microrna profiles in colon cancer. bjc.2013)
使用芯片：exiqon mircury lna™ universal rt microrna pcr panel
研究者通过比较：1）结肠癌和健康对照，2）早期和晚期结肠癌病人的血清microrna表达，筛选得到了可以作为早期诊断标记物的21个microrna。这些microrna中的一部分与结肠癌组织和细胞水平的研究得到的microrna有重叠，另外一部分则是在其他癌症中发现的重要的microrna。由于microrna的调控是一个复杂的网络，所以采用一组而不是某一个microrna作为分子标记物会更加可靠。基于此研究成果，还将在更多的临床样本，不同种族的群体中进行microrna标志物的验证。
2.功能机制研究
high dose glargine alters the expression profiles of micrornas in pancreatic cancer cell, 2012, wjg）
甘精胰岛素（glargine）是临床上用于糖尿病治疗的药物，但与胰腺癌的患病风险风险提高有关，本研究从microrna分子水平揭示其促癌的分子机制。首先应用exiqon microrna ready- to- use human panel i检测甘精胰岛素刺激下胰腺癌细胞(sw1990)的microrna表达谱变化，筛选得到12个表达变化的microrna其中mir-95的变化倍数最高。而后围绕着mir-95展开的细胞以及动物模型的实验并证明mir-95具有促进癌细胞增殖、转移，以及肿瘤组织生长的作用。
→ mir-449a, a potential diagnostic biomarker for wnt group of medulloblastoma. j neuro-oncol. 2016
→ mir-28-3p as a potential plasma marker in diagnosis of pulmonary embolism. thromb res. 2015
→ diagnostic value of a plasma microrna signature in gastric cancer: a microrna expression analysis. sci rep. 2015
→ identification of differential micrornas in cerebrospinal fluid and serum of patients with major depressive disorder. plos one. 2015
→ plasma mir-122 and mir-192 as potential novel biomarkers for the early detection of distant metastasis of gastric cancer. oncol rep. 2014
→ aberrant mirna profiles associated with chronic benzene poisoning. exp mol pathol. 2014
→ serum mir-19a predicts resistance to folfox chemotherapy in advanced colorectal cancer cases. asian pacific journal of cancer prevention. 2013
→ high dose glargine alters the expression profiles of micrornas in pancreatic cancer cells. world journal of gastroenterology. 2012
→ metformin alters the expression profiles of micrornas in human pancreatic cancer cells. diabetes research and clinical practice. 2012
