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microrna实时定量pcr

  • 简介
  • 客户案例
  • 服务流程

  •        实时荧光定量pcr技术是在普通pcr反应体系中加入荧光试剂，利用荧光信号实时检测pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量pcr能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度。成熟microrna是由21-25个核苷酸组成的小rna，由于长度太短，不能通过传统的实时定量pcr进行检测。本公司通过特殊设计的茎环结构的反转录引物，配合实时定量pcr引物及探针可以精确检测微量样品中microrna表达水平，也可以用终点pcr法定性检测。

    康成生物为您提供microrna实时定量pcr技术服务，您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，本公司专业的技术服务人员就可替您完成microrna实时定量pcr实验操作和数据分析，提供给您完整的实验报告，为您节省大量的时间和精力。

  • signature microrna expression profile of essential hypertension and its novel link to human cytomegalovirus infection. circulation, 2011.
           研究者首先采用exiqon mircury lna™芯片(v11.0)检测13例高血压患者和5例健康人血浆样本的microrna表达谱，发现27个表达差异的microrna。随后对第二组24例高血压患者和22例健康人的血浆样本，应用实时定量pcr方法对芯片筛选出的表达有变化的microrna进行验证（见下图）。pcr结果和芯片结果一致。并进一步在第三组，194例高血压患者和97例健康人的血浆样本中应用实时定量pcr方法对挑选出的重要microrna进行检测。发现与健康人相比，hcmv编码的hcmv-mir-ul112在高血压患者的血浆中表达明显上调。

    上图：microrna qpcr验证microrna芯片数据。从microrna芯片数据挑选了20个差异表达的microrna，利用荧光定量pcr进行验证，结果显示与microrna芯片得出的表达趋势基本一致。红色表示健康人样本，绿色表示高血压病人样本，microrna的表达量经过snrna u6归一化。


  • 1. 引物设计、合成

           设计并合成目的microrna的茎环rt引物、pcr引物和检测用荧光探针，并合成该microrna相应的dna寡核苷酸作为标准。
    2. 样品rna抽提
           a．组织样品：取适量（50～100mg）新鲜组织或正确保存的组织样品，匀浆后用purelinktm试剂抽提rna。
           b．细胞样品：取1×106～1×107细胞，pbs清洗细胞，吸去pbs后用purelinktm试剂抽提rna。
    3. rna质量检测
           a．紫外吸收测定法测定rna在波长260nm和280nm的吸收值，获得rna的浓度并通过a260/280及a260/230的吸收比值判断rna的纯度。

           b．甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测rna纯度和完整性。
           注：用于microrna实时定量pcr检测的rna样品，必须高纯度、完整，没有rnase污染（降解的样品不能用于实时定量pcr检测），同时提取方法必须保证所得样品包含完整的小rna部分。
    4. 逆转录合成cdna    

           利用茎环引物逆转录合成cdna第一链。
    5. 实时定量pcr
           以合成的cdna作为模板进行实时定量pcr扩增，梯度稀释的标准同时进行实时定量pcr扩增，根据ct值制备标准曲线。以同样的方法测定每个样品中u6 snrna含量作为内参，校正上样误差。
    6. 分析结果、提供实验报告
           分析实时定量pcr结果，根据标准曲线定量样品中的目的microrna。提供实验报告，包括详细的实验方法，实时定量pcr实验数据和图表。



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