mirstar™ mirna pcr芯片

• 简介
• 产品优势
• 实验流程
• 分析流程

•        美国arraystar公司是非编码rna研究领域的领导者， 近期arraystar公司发布了创新性的mirstar™癌症特异性microrna pcr系统，能够帮助客户快速筛选microrna分子标志物，或是解析microrna的调控机制和功能。其中，mirstar™癌症特异性microrna芯片聚焦于血清oncomir（癌症相关的mirna）,是microrna癌症分子标志物的筛选利器；而mirstar™癌症特异性microrna &靶基因pcr芯片能够同时检测癌症相关的microrna和它们的靶基因，评估这些microrna对靶标mrna的调控活性，从而帮助研究者筛选到癌症中最为核心的功能microrna分子，并迅速了解其调控机制和功能。

  aksomics（原康成生物）是arraystar公司中国地区唯一代理商，独家为您提供arraystar公司mirstar™ microrna pcr芯片全程一站式技术服务，您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，aksomics的芯片技术服务人员就可为您完成全部实验操作，并提供完整的实验报告。

  
  

  mirstar™癌症特异性microrna pcr芯片产品列表

  服务	芯片	规格	描述
  mirstar™ human cancer focus microrna pcr array service	human cancer focus microrna pcr array	384-well plate	184个血清oncomir
  mirstar™ human cancer focus microrna & target mrna pcr array service	human cancer focus microrna & target mrna pcr array	384-well plate	184个癌症相关的microrna 178个靶基因

  
  

  mirstar™癌症特异性microrna芯片---聚焦于血清oncomir,分子标志物筛选利器

         microrna在癌症等疾病状态下发生显著的表达改变，多年积累的大量研究结果支持microrna与癌症的密切关系。近年来，研究进一步发现，microrna在血清，血浆，尿液等临床样品中稳定存在。基于microrna，特别是血清血浆microrna 的癌症分子生物学标记物（biomarker）筛选方兴未艾。为了帮助客户筛选microrna癌症分子标志物，arraystar公司创新性的开发了mirstar™癌症特异性 microrna芯片。 mirstar™癌症特异性 microrna芯片聚焦于血清血浆oncomir。它涵盖了184个从最新的权威数据库和经典文献中精心收集的，与胃癌﹑肝癌﹑肺癌﹑乳腺癌﹑卵巢癌﹑结直肠癌﹑胰腺癌﹑前列腺癌等常见肿瘤相关的microrna（oncomir）。更为重要的是，这些癌症相关的microrna都在血清样品中经过了严格的测试，证明了其在血清中的稳定存在，因此非常适合于分子标志物的筛选。

  

  *图释：血清microrna是重要的癌症诊断分子标记物

  
  

• microrna作为分子生物学标记物的优势

  ● 在血清/血浆，ffpe等临床样品中高度稳定

  ● mirna表达的呈现出高度的组织/疾病特异性

  ● 单个mirna往往可以调控数以百计的靶基因，因此只需通过少量的mirna分子标志物就可相对准确的对疾病进行诊断和预后判断

  ● mirna是重要的调控分子，不仅可以用作诊断（diagnosis）和预后（prognosis）标志物还可以作为治疗靶点

  
  

  1. 最优的覆盖——对癌症相关的microrna最全面，最及时的收集

         arraystar实时的关注各种权威的文献和数据库，并通过严谨的筛选流程从中收集癌症关系最密切的microrna。mirstar™ 癌症特异性microrna pcr芯片是市场上对癌症相关的microrna覆盖最全面、更新最及时、最合理的pcr芯片产品(见下表)。

  癌症类型	mirna数目
  乳腺癌	157
  胃癌	97
  肺癌	156
  肝癌	113
  卵巢癌	123
  结直肠癌	130
  胰腺癌	139
  前列腺癌	140

  *图释：mirstar™癌症特异性 microrna pcr芯片覆盖的与特定癌症相关的microrna数目。

  
  

  2. 验证过的性能——芯片上的所有microrna引物都在血清样品中验证过

         mirstar™ 癌症特异性microrna pcr芯片上每条microrna引物都经过了精心的设计，并且在血清血浆样品中进行了验证（见下图）。预验证的结果既确保了芯片的可靠性，又证实了这些癌症相关的microrna在血清血浆中的稳定性，进一步预示了其作为癌症分子标志物的可能性。

  

  *图释：在血清样品中，使用mirstar™ 预验证的 hsa-mir-142-3p特异性pcr引物的实时定量pcr扩增曲线（a）和熔解曲线（b）。溶解曲线呈现锐利的单峰，表明了反应具有很高的特异性。

  
  

  3. 同时检测两个样品——样品间技术误差可以忽略不计

         mirstar™癌症特异性 microrna pcr芯片可以在同一块pcr板上同时检测2个样品，如癌症样品 vs 正常样品或是两个生物学重复，样品间的技术误差几乎可以忽略不计。

  
  

  4. mirstar™癌症特异性microrna & 靶基因芯片——同时检测microrna和靶基因,microrna功能解析利器

         microrna可以通过碱基互补的方式和靶标mrna结合，而后降解mrna沉默基因的表达。一个microrna 可以调控近百个不同的mrna分子，另一方面，一个mrna也能够结合多个不同的microrna. 由此形成microrna-靶基因网络调控关系。在癌症研究领域中，microrna已经成为一个非常重要的部分。不同类型癌症样品具有不同的基因表达模式，因此，即使是相同的microrna，它们在不同类型的癌症样品中的调控的靶基因往往是不同的。

         传统的microrna检测平台只检测microrna的表达状况，不能平行的检测microrna和靶基因，从而无法全面的了解microrna-靶基因调控网络。

         arraystar公司开创性的设计了mirstar™microrna pcr芯片系统，可以同时检测癌症相关的microrna和它们的靶基因。它不仅能够快速检测样品中癌症相关的microrna的表达变化，还可以评估这些microrna对靶标mrna的调控活性，从而帮助研究者筛选到疾病中最为核心的功能microrna分子，并迅速了解其调控机制和功能。

  同时检测癌症相关的microrna和靶基因

         mirstar™癌症特异性microrna & 靶基因 pcr芯片包含癌症相关的184个microrna以及这些microrna的178个靶标mrna分子。184个microrna是从最新的文献中精心筛选，涵盖了与胃癌，肝癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，结直肠癌，胰腺癌，前列腺癌等常见肿瘤相关的microrna（见下表）。178个靶mrna有大量的文献支持，其表达水平的变化与肿瘤中microrna的功能活性改变有关。通过创新性的实验设计（见下图），mirstar™癌症特异性microrna & 靶基因 pcr芯片实现了对microrna和 靶mrna的同时检测，采用高效，优化的实验流程，起始rna量可低至50ng。

  

  *图释：mirstar™癌症特异性microrna & 靶基因 pcr芯片包含的microrna（黄色背景），mrna（紫色背景）和内参（红色方框。

  

  *图释：mirstar™癌症特异性microrna & 靶基因pcr芯片工作流程。

  
  

  
  

  
  

• 1.样品rna抽提

         a.实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，使用biopulverizertm冰冻粉碎组织，加1ml的rna抽提试剂trizol（invitrogen），使用mini-bead-beater-16匀浆后抽提rna。

         b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，加1ml的rna抽提试剂trizol（样品为贴壁细胞，每10cm2培养皿trizol使用量为1ml），裂解后抽提rna。

  2.dnase i消化rna样品

         dnase i在37°c温育处理rna样品，去除rna抽提过程中可能混入的基因组dna。

  3.rna纯化

         rneasy minelute纯化试剂盒（qiagen）对dnase i处理的rna样品纯化回收，以得到单纯的rna样本。

  4.rna质量检测

         a.使用nanodrop测定rna在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。

         b.用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测rna纯度及完整性。

         c.提供rna qc报告。

  5.cdna合成

         按照mirstartm第一链cdna合成试剂盒使用说明将样品rna逆转录为cdna (oligo dt和mirstartm microrna反转引物)。

  6.实时定量pcr

         按照芯片说明将cdna模板适当稀释后加入到实时定量pcr反应混合液中，然后在含有基因特异性引物的384孔板各孔中加入等量反应液，进行实时定量pcr反应。

  7.数据分析

         利用配套软件计算pcr芯片中的各个基因的ct值，采用公认的δδct方法比较基因的表达变化。

         a.计算每个处理组中的每个microrna和靶基因的δct（microrna和靶基因分别用各自的内参基因）。

         δct (ctrl) = average ct - average of hk genes’ct for ctrl array

         δct (exp) = average ct - average of hk genes’ct for exp array

         b.计算2个pcr array中每个基因的δδct。

         δδct = δct (exp) - δct (ctrl)

         c.通过2-δδct计算exp（实验组）与ctrl（对照组）间基因的表达差异。

  8.提供实验报告

         gene table（pcr板所含的基因列表）

         excel芯片结果汇总表（包括芯片原始结果、数据分析和各种图表）

  
  

  
  

• aksomics microrna pcr芯片数据分析

  1.差异microrna筛选

         microrna的qpcr数据展示在“microrna expression data”数据表格中，表达有差异（>2倍）或有显著性（p<0.05）的数据用有颜色的字体标注，客户可以很方便的根据自身要求，利用倍数变化和p值在列表中筛选差异microrna，常用筛选标准：倍数变化>2倍，p<0.05。

  

  *图释：差异microrna筛选示例

  
  

  2. 差异mrna筛选 (仅适用于mirstar™癌症特异性 microrna & 靶基因芯片)

         靶mrna的qpcr数据展示在“mrna expression data”数据表格中，表达有差异（>2倍）或有显著性（p<0.05）的数据用有颜色的字体标注，客户可以很方便的根据自身要求，利用倍数变化和p值在列表中筛选差异microrna，常用筛选标准：倍数变化>2倍，p<0.05。

  

  *图释：差异mrna筛选示例 

  
  

  3. 差异microrna与靶mrna的联合分析 (仅适用于mirstar™癌症特异性 microrna & 靶基因芯片)

          我们还将差异表达的microrna（一般筛选标准为：倍数变化>=2倍，p<0.05）与其靶mrna的表达数据进行整合，相应的数据展示在“microrna-mrna data”数据表格中。如果microrna的靶基因与其表达趋势相反，并且也在样品组间呈现出显著性的差异，那么在此类样品中这个靶基因可能是此microrna真实的靶基因。microrna与靶mrna的作用位点，可能的细胞学功能，以及相应的实验证据来源也列在表格中。

  

  *图释： 差异microrna和靶mrna的联合分析示例

  
  

  4. 散点图

         客户可以根据散点图直观的看到表达上下调的基因，及其上下调程度

  
  

  

  *图释：散点图示例。位于灰色条带上方的是上调倍数大于2倍的microrna/mrna，位于灰色条带下方的是下调倍数大于2倍的microrna/mrna

  5. 3d图
         可以直观的了解表达上下调的基因，及其在pcr板上的位置

  

  
  

  *图释：3d图示例。纵轴为基因表达倍数变化，横纵轴分别代表相应基因在pcr板上的位置。