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蛋白相对定量 tmt标记定量技术 非标定量技术 |
蛋白修饰 tmt标记定量磷酸化 非标定量磷酸化 |
rna/蛋白-蛋白相互作用 rna-蛋白相互作用 蛋白-蛋白相互作用 |
近期，哈尔滨医科大学附属第二医院孙亚男教授发表名为“rbm15 facilitates laryngeal squamous cell carcinoma progression by regulating tmbim6 stability through igf2bp3 dependent”的研究性论文。该论文应用arraystar human m6a mrna & lncrna表观转录组芯片发现，rbm15通过对tmbim6进行m6a修饰，使tmbim6的mrna稳定性上升，最终促进喉鳞状细胞癌的发生发展。该研究成果于2021年2月发表在国际著名学术期刊《journal of experimental & clinical cancer research》（if: 7.1）上。（m6a表观转录组芯片由康成生物丨数谱生物提供技术服务）
研究背景
作为目前的热门研究领域之一，rna的表观修饰吸引了大量研究者的目光，在这一领域中，m6a修饰是研究最多的一类。这一修饰的特征是在核糖核苷酸的a碱基上添加一个甲基基团，进而影响对应rna分子的功能。已知和m6a修饰相关的蛋白主要可以分为三类，首先，writer蛋白负责将修饰添加到rna分子上，这类蛋白包括mettl3、rbm15等。其次，eraser蛋白负责将修饰从rna分子上去除，主要包括alkbh5、fto等蛋白。最后，reader蛋白能够识别rna分子上的m6a修饰，进一步与该分子结合后发挥相应的调控功能，例如igf2bp家族蛋白使得rna分子更加稳定，yhtdf1促进mrna翻译等等。
喉鳞状细胞癌作为一类常见的恶性肿瘤，每年可造成我国约三万人患病。其主要症状包括咳血，咳痰，颈部淋巴结转移等。关于喉鳞状细胞癌的治疗，目前虽然发展了多种治疗方法，但这些方法对于患者五年期生存率并没有显著的改善。因此，开发新的有效治疗方法，提高患者的生存率便显得尤为重要。
本次研究系统地探讨了m6a修饰在喉鳞状细胞癌中的作用，发现了喉鳞状细胞癌中与m6a修饰相关的一系列蛋白以及其作用机制，对于后续相关疾病的治疗，开发新型治疗方法具有重要的参考价值和指导意义。
研究思路
预实验发现rbm15与喉鳞状细胞癌相关
为了研究影响喉鳞状细胞癌（lscc）发生发展的相关因素。作者首先检测了lscc患者的癌组织以及癌旁组织，发现在癌组织中m6a水平有显著上调。据此，作者通过pcr等实验找到了在癌组织中显著上调的m6a修饰酶基因rbm15。随后，作者在细胞以及小鼠模型中过表达或敲低rbm15，发现rbm15能够显著促进肿瘤的生长。
arraystar human m6a mrna & lncrna表观转录组芯片筛选
由于m6a修饰主要通过影响下游的靶基因来发挥功能，在已有文献里面这部分内容也是大家讨论的重点部分。因此作者接下来就采用了arraystar human m6a mrna & lncrna表观转录组芯片对下游的靶基因进行筛选。通过比较野生型lscc细胞与敲低rbm15的lscc细胞间的差异m6a修饰基因，作者找到了tmbim6。通过merip-pcr等实验，作者发现rbm15能够提高tmbim6的m6a修饰水平，并且rbm15也可以提高tmbim6的mrna水平，表明rbm15可能通过调控tmbim6的表达水平来发挥功能。
tmbim6功能研究
为了进一步确定tmbim6在lscc发生发展中的作用，作者研究了tmbim6的功能。通过transwell小室等实验，作者发现tmbim6能够促进lscc细胞的侵袭能力。在小鼠层面的研究则发现tmbim6能够促进肿瘤的产生，说明tmbim6与lscc的发生发展具有密切关系。
机制研究
为了研究tmbim6下游的reader蛋白，首先作者根据文章前半部分的工作，发现m6a修饰酶rbm15的敲低与tmbim6的mrna水平下降可能相关。而已有文献表明，与m6a修饰相关的reader蛋白中，igf2bps家族蛋白能够提高mrna的稳定性。据此，作者通过检测表达水平的变化最终找到了igf2bp3。接下来作者通过rip等实验发现，m6a修饰的tmbim6能够与igf2bp3结合，过表达igf2bp3则能够提高tmbim6的mrna稳定性，导致相应mrna表达量上升。随后通过mazf pcr等实验验证了tmbim6上m6a修饰位点的存在（ggaca），将该修饰位点突变之后，igf2bp3就不能发挥相应的功能，表明igf2bp3提高tmbim6的mrna稳定性的功能依赖于该修饰位点。最后，功能研究表明，igf2bp3也具有类似的促癌效果，进一步证实了m6a对于喉鳞状细胞癌的促进作用。
技术路线
结果展示
图1. 预实验发现rbm15与喉鳞状细胞癌相关
a：lscc癌组织中m6a总量高于癌旁组织。b：pcr实验发现lscc癌组织中rbm15表达量高于癌旁组织。c：小鼠成瘤实验表明，敲低rbm15抑制肿瘤生长。
图2. arraystar human m6a mrna & lncrna表观转录组芯片筛选
a：敲低rbm15前后差异m6a修饰表观转录组芯片结果聚类图（实验组与对照组各3个样本）。b：四象限图展示在实验组与对照组的比较中，m6a修饰量以及转录本表达量均有变化的mrna。c：merip-pcr实验发现，在lscc的细胞系中tmbim6被m6a修饰，同时过表达rbm15能够进一步提高tmbim6的m6a修饰水平。d：pcr实验发现，相比于野生型细胞，敲低rbm15的细胞中tmbim6表达量更低。
图3. tmbim6功能研究
a：transwell小室实验发现tmbim6能够促进癌细胞的迁移和侵袭。b：小鼠成瘤实验表明tmbim6能够促进肿瘤生长。
图4. 机制研究
a：rip-pcr实验发现igf2bp3能够与tmbim6结合，敲低rbm15会抑制它们的结合。b：pcr实验表明，过表达igf2bp3能够导致tmbim6的mrna水平升高。c：利用mazf pcr验证，找到tmbim6的m6a修饰位点（ggaca），并据此设计位点突变实验。d：双荧光素酶实验发现igf2bp3促进tmbim6的mrna稳定性的功能依赖于mazf pcr检测到的m6a修饰位点。e：transwell小室实验表明，igf2bp3敲低会抑制肿瘤细胞的迁移与侵袭。
研究意义：
在发现rbm15调控喉鳞状细胞癌内的m6a水平后，作者通过arraystar human m6a mrna & lncrna表观转录组芯片进行筛选，找到了受rbm15调控的靶基因tmbim6。功能研究发现，tmbim6在细胞和小鼠层面上都能够促进癌症的发生发展。进一步的机制研究表明，tmbim6的m6a修饰能够帮助招募igf2bp3，并且作者通过mazf pcr等实验在单碱基水平上鉴定出影响二者结合的m6a修饰位点。igf2bp3能够提高tmbim6的mrna稳定性，促进tmbim6的表达，从而促进癌症的发生发展。总体而言，这项工作思路清晰，数据详实，具有很高的科研价值与应用价值，为喉鳞状细胞癌的治疗提供了新的思路与方法。
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