近期，哈佛大学医学院附属布莱根妇女医院godlewski教授发表名为“the nuclear dicer–circular rna complex drives the deregulation of the glioblastoma cell micrornaome”的研究性论文。该论文应用arraystar human circrna芯片验证了一个环状rna分子circ2082在胶质母细胞瘤中表达异常升高，而circ2082能够通过dicer蛋白影响下游整体的基因表达情况进而促进肿瘤生长。该研究成果于2020年12月发表在国际著名学术期刊science advances (if: 13.116)上。（芯片实验由arraystar提供技术服务）
研究背景
胶质母细胞瘤作为一种常见的脑部恶性肿瘤，主要由星型胶质细胞癌变产生。由于该肿瘤具有浸润性高等特点，即使进行手术切除以及高度积极的治疗也难以避免肿瘤的复发。有临床数据表明，胶质母细胞瘤患者的生存期中位数仅为1年。因此，对于胶质母细胞瘤发生发展的机理研究对于相关疾病的治疗具有非常重要的价值。
环状rna（circrna）是一类将线性rna分子的3’端和5’端通过反向剪切共价连接形成的环状rna分子，可以由外显子、内含子或者同时包含这两种序列的片段组成。与线性分子相比，这种环形的结构可提高环状rna的稳定性。环状rna发挥功能的机制包括结合特定的蛋白来调控靶蛋白的功能，参与cerna调控机制等。
mirna是一类长17-25nt的小非编码rna，主要功能包括与目的rna结合从而抑制翻译或导致其降解等。mirna的加工成熟主要分为两步，从最初的pri-mrna剪切形成pre-mirna，进一步对pre-mirna进行剪切最终形成成熟mirna。在这一过程中，细胞质里的dicer参与了pre-mirna的剪切，因而对于mirna的成熟非常重要。
本次研究系统地探讨了环状rna在胶质母细胞瘤发生发展中的作用，提出了环状rna通过结合蛋白来影响mirna发挥功能的新机制，对于后续相关研究具有重要的借鉴意义。
技术路线
研究思路
tcga数据库数据分析
为了研究影响胶质母细胞瘤发生发展的机制。作者采用tcga数据库数据进行分析，挑选了490例胶质母细胞瘤患者数据以及11例正常人数据进行比较，发现在胶质母细胞瘤患者中，整体mirna的表达量偏低。此外，pca分析发现，对比胶质母细胞瘤患者与正常人体内的mirna表达谱，两者间具有明显差异。因此作者考虑是否胶质母细胞瘤患者癌细胞内mirna加工成熟机制遭到破坏。
circ2082在细胞核内结合dicer
mirna加工成熟包括了pri-mirna在细胞核内剪切产生pre-mirna，pre-mirna出核之后在细胞质中的dicer作用下被剪切产生成熟的mirna。作者通过核质分离后western blot检测等实验发现，在间充质型胶质母细胞瘤干细胞以及前神经元型胶质母细胞瘤干细胞中，dicer均存在显著的细胞核定位的现象，从而阻止其在细胞质中促进mirna的成熟。随后，作者利用胶质母细胞瘤干细胞的细胞核与细胞质组分进行了ip等实验，发现dicer在细胞核中与rbm3结合。更重要的是，通过使用dicer抗体，在胶质母细胞瘤干细胞的细胞质组分中进行rip实验，将rna产物进行测序，作者发现了能够与dicer结合的环状rna分子，circ2082。
arraystar human circrna芯片验证
为了进一步研究胶质母细胞瘤干细胞中环状rna分子的分布情况，作者选取非恶性神经祖细胞(n=3)，间充质型胶质母细胞瘤干细胞(n=4)以及前神经元型胶质母细胞瘤干细胞(n=4)进行arraystar human circrna芯片筛选以及q-pcr验证。筛选结果表明circ2082在胶质母细胞瘤干细胞内显著上调，且在整体环状rna表达谱内排名前五，说明circ2082对于胶质母细胞瘤的发生发展具有非常重要的影响。
功能研究
为了证明circ2082具有促癌效果，首先作者在细胞层面上进行干细胞成球等实验，结果表明敲低circ2082会导致胶质母细胞瘤干细胞的增殖减弱。个体层面上，通过尾静脉注射等实验，作者发现在注射的胶质母细胞瘤干细胞中敲低circ2082能够显著延长被注射小鼠的生存期。最后，作者利用tcga数据库中相关数据分析，通过km曲线发现circ2082的下降能够提高胶质母细胞瘤患者的生存时间。
机制研究
接下来，作者研究了circ2082发挥促癌功能的具体机制。首先，免疫荧光等实验表明，在胶质母细胞瘤干细胞中敲低circ2082能够导致dicer重新分布在细胞质中，从而促进大部分mirna（包括重要的抑癌mirna，如mir-128、mir-124、mir-1等）的表达上调。除此之外，重要的促癌mirna例如mir-21等则出现下调，表明circ2082除了能够抑制整体mirna的表达外，也可能存在其他促进肿瘤发生发展的机制有待深入研究。随后，作者采用agilent whole human genome芯片检测了mrna的表达变化情况，发现在基因层面上，circ2082发挥的促癌功能受不同细胞亚型的影响很大。
结果展示
图1. 胶质母细胞瘤患者mirna表达整体偏低
a：胶质母细胞瘤患者（n=490）与正常人（n=11）的成熟mirna表达谱热图。细胞亚型：红色，间充质型；蓝色，典型；绿色，前神经元型。535个mirna表达数据来源于tcga数据库。
b：pca分析能够区分胶质母细胞瘤患者成熟mirna组（红点，n=490）与正常人成熟mirna组（蓝点，n=10）。
图2. circ2082在细胞核中结合dicer
a：western blot检测dicer在细胞质（c）和细胞核（n）中的分布。npc：非恶性神经祖细胞；m gsc：间充质型胶质母细胞瘤干细胞；p gsc：前神经元型胶质母细胞瘤干细胞。
b：在胶质母细胞瘤干细胞细胞核组分中分别以igg抗体以及dicer抗体进行rip实验，随后q-pcr检测circ2082的含量。
c：使用同向引物与反向引物在cdna或者基因组dna中pcr验证circ2082的环状特征。
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图3. arraystar human circrna芯片验证
a：差异环状rna表达谱聚类图。青色：非恶性神经祖细胞（n=3）；红色：间充质型胶质母细胞瘤干细胞（n=4）；绿色：前神经元型胶质母细胞瘤干细胞（n=4）。
b：胶质母细胞瘤干细胞内差异环状rna火山图。虚线为筛选阈值，标识出的环状rna为差异上调前五的环状rna。
c：q-pcr验证胶质母细胞瘤中circ2082存在表达上调的现象。
图4. circ2082具有促癌效果
a：细胞成球实验表明敲低circ2082能够抑制胶质母细胞瘤干细胞的生长能力。
b：生存分析表明，尾静脉注射敲低circ2082胶质母细胞瘤干细胞的小鼠具有更长的生存期。
c：使用tcga数据库内的临床数据进行km分析表明，circc2082表达较低的患者具有更高的生存期。
图5. circ2082影响dicer定位与相关基因表达
a：免疫荧光实验表明，在胶质母细胞瘤干细胞内敲低circ2082会导致dicer出核。
b：mirna表达谱的聚类图显示，在间充质型胶质母细胞瘤干细胞（m gsc）与前神经型胶质母细胞瘤干细胞（p gsc）内敲低circ2082会导致整体mirna表达上升，且不同细胞亚型间差异不大。
c：q-pcr分析不同亚型肿瘤干细胞敲低circ2082后相应mirna的变化情况。
d：agilent whole human genome芯片分析敲低circ2082后对肿瘤干细胞整体基因表达的影响。
研究总结
作者首先通过tcga数据库数据分析，发现胶质母细胞瘤患者体内mirna表达整体偏低，据此将研究目标锁定在对mirna加工成熟具有重要功能的蛋白dicer上。通过前期核质分离wb检测以及免疫荧光等实验，作者发现在肿瘤细胞中dicer具有异常的细胞核定位，据此通过rip实验发现dicer在细胞核中结合的环状rna分子circ2082。进一步，作者利用arraystar human circrna芯片对胶质母细胞瘤干细胞中的差异环状rna进行筛选，结果表明circ2082在整体的环状rna表达谱上属于上调前五的rna分子。接下来，在功能研究部分，作者对circ2082进行敲低，发现其能够影响肿瘤干细胞的成球能力。此外，个体层面上的研究发现circ2082能够影响小鼠的生存期以及临床患者的生存期，说明circ2082具有促癌的功能。机制上看，circ2082能够影响dicer的细胞内定位，从而影响细胞整体的mirna表达。同时，circ2082的敲低除了能够解除抑癌mirna的表达抑制之外，还能够抑制促癌mirna的表达。最后，作者发现，基因层面上circ2082发挥的促癌功能受不同细胞亚型的影响很大。总体而言，作者的研究思路清晰，数据详实，为胶质母细胞瘤的治疗提供了新的思路与方法。
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康成生物丨数谱生物可提供的相关技术服务 circrna 表达研究技术平台: circrna表达谱检测——arraystar circrna芯片： 针对circrna反向剪接位点设计特异性探针，准确检测circrna，比测序更适合于circrna表达谱分析。助力客户发表sci文章超过350篇； 技术成熟，circrna反向剪接位点设计引物，特异性检测目标circrna。 circrna与蛋白互作(circrna chirp-ms) circrna可作为蛋白海绵或者蛋白结合的骨架，影响蛋白功能。 circrna chirp-ms通过用biotin标记的rna anti-sense与已交联的样本进行杂交，并通过固定化avidin对biotin进行pull-down，得到rna结合蛋白（rbp）并通过质谱鉴定目标circrna结合的蛋白。
mirna研究平台
其他circrna研究技术平台： circrna m6a检测——arraystar circrna表观转录组芯片：
检测发生m6a修饰的circrna；定量修饰百分比及修饰变化；total rna要求量低至3ug。
circrna m6a 甲基化pcr检测： （1）验证或者检测某个m6a 修饰的circrna：m6a抗体富集发生m6a修饰的circrna circrna反向剪接位点设计引物保证m6a-circrna的精确检测 （2） 确定含有潜在m6aca位点的circrna是否真实发生m6a修饰：rnase r去线性rna mazf酶处理 m6aca位点pcr检测 。
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