circrna是通过反向剪切形成的特殊类型的环形rna分子，它通过调控基因转录和剪切[1,2]、编码小肽[3,4]以及利用其mirna结合位点吸附mirna[5,6]来发挥生物学功能。与mrna类似，m6a也是circrna内部最丰富的表观转录组修饰[7]。从生成机制上看，circrna的m6a修饰主要由m6a修饰酶mettl3和mettl14添加并被去修饰酶fto和alkbh5可逆性的去除。
m6a修饰在维持circrna生物学活性上具有重要的功能。m6a修饰除了具有调节circrna稳定性的经典功能之外[7]，还可以通过调控circrna与mirna互作来影响circrna作为mirna吸附海绵的功能，或者是影响circrna和rna结合蛋白（rbp）之间的相互作用[8]，此外还可以标记内源rna，从而将其与外源rna区分开，避免被自身免疫系统识别攻击[9]。
值得注意的是，一个circrna所有转录本上m6a的修饰比例在同一细胞中经常发生改变。而同一个circrna的不同修饰比例（修饰化学计量数的比值）可能导致细胞具有不同的命运，因此确认circrna修饰百分比与其功能后果高度相关[10,11]。
m6a调控circrna稳定性的经典功能
环状rna上m6a修饰的经典功能就是调控对应rna的稳定性。从机制上看，主要利用了ythdf2读取circrna的m6a修饰，随后该蛋白结合hrsp12衔接蛋白并招募核糖核酸内切酶rnaser/mrp，核酸内切酶切开rna环，导致m6a修饰的circrna迅速降解（图1）[12]。
图1. ythdf2可以读取m6a，将hrsp12衔接蛋白和rnase p/mrp复合物招募至ythdf2结合位点上游的hrsp12结合位点和下游的rnase p/mrp切割位点。circrna进而被切开并快速降解。
m6a的其他非经典功能
circrna的m6a修饰促进非帽依赖的翻译
circrnas是共价的rna环状结构，没有5’或 3’的游离末端。由于缺少5’端的m7g 帽子结构，不能像mrna一样招募翻译起始复合物，因此大部分的circrna不具有编码蛋白的能力。但是，一些circrna内部含有m6a修饰位点，通过与ythdf3识别蛋白结合，也可以招募翻译起始复合物开始翻译蛋白(图 2) [13]。目前环状rna通过质谱鉴定的由非帽依赖产生的多肽产物已有上百种。
图2. circular rna的m6a修饰 促进非帽依赖的蛋白翻译。识别蛋白ythdf3结合circrna m6a修饰位点，进而招募翻译起始因子4g2，4a，4b以及40s核糖体小亚基形成43s转录起始复合物，导致circrna的非帽依赖翻译发生 [13]。
circrna的m6a修饰调控circrna与rna结合蛋白（rbp）的相互作用
circnsun2是一个通常在伴随肝转移的结直肠癌中表达上调的circrna。circnsun2的m6a修饰促进circnsun2转运到细胞质，在细胞质中m6a修饰的circnsun2引导igf2bp2结合hmga2 mrna，促进circnsun2/igf2bp2蛋白/hmga2 mrna三元复合物形成，从而增强hmga2 mrna稳定性并促进hmga2翻译（图3）[14]。
图3. circnsun2的m6a修饰促进circnsun2转运到细胞质。在细胞质中，m6a修饰的circnsun2促进circnsun2/igf2bp2蛋白/hmga2 mrna三元复合物形成，从而增强hmga2 mrna稳定性并促进hmga2翻译。hmga2上调促进结直肠癌转移进程[14]。
circrna m6a修饰与cerna机制
circrna的m6a修饰与癌症密切相关，因为circrna通常具有多个microrna结合位点，能够结合microrna并抑制其发挥功能。而已知许多microrna则能作为促癌microrna参与癌症的发生发展，m6a修饰就能够影响circrna与microrna的结合。
m6a控制“自身的”和“外来的”circrna免疫
外源circrnas（例如病毒rna来源）可以通过宿主防御促进抗病毒基因表达（例如干扰素）以及引发强烈的免疫反应。然而，由于生物体内也存在类似的circrna分子。因此如何识别内源性circrna，避免其引发不恰当的免疫反应就是一个很重要的问题。关于这一问题，目前有研究表明，内源性的circrna会发生m6a修饰，被yth蛋白读取，从而被识别为“自身的”分子，进一步抑制促进干扰素产生的视黄酸诱导基因i（rig-i）的激活[9]。因此，m6a可作为识别“自身”与“外源”circrna的标记。
另一个案例是hpv病毒来源的环状rna circe7。m6a修饰赋予circe7翻译转化的原癌蛋白的能力[15]，同时m6a标记circe7为“自身的”来帮助病毒逃脱宿主的抗病毒免疫反应。
图4. m6a修饰的内源circrna被ythdf2识别为“自身的”分子，进而阻断rig-i的激活。未经m6a修饰的外源circrna在k63连接的多聚泛素分子存在的情况下激活rig-i，从而导致抗病毒信号通路的激活和干扰素的产生[9]。
m6a在circrna中的功能不仅限于rna稳定性，而且在多肽翻译、circrna-mirna吸附海绵、circrna-rbp结合、circrna核转运、靶mrna周转和circrna免疫方面均具有功能。因此对circrna进行m6a修饰筛选开辟了表观转录组学的一个新的研究领域。
参考文献
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[8] huang, a., et al. (2020) "circular rna-protein interactions: functions, mechanisms, and identification" theranostics 10(8):3503-3517 [pmid: 32206104]
[9] chen, y. g., et al. (2019) "n6-methyladenosine modification controls circular rna immunity" mol cell [pmid: 31474572]
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[14] chen, r. x., et al. (2019) "n(6)-methyladenosine modification of circnsun2 facilitates cytoplasmic export and stabilizes hmga2 to promote colorectal liver metastasis" nat commun 10(1):4695 [pmid: 31619685]
[15] zhao, j., et al. (2019) "transforming activity of an oncoprotein-encoding circular rna from human papillomavirus" nat commun 10(1):2300 [pmid: 31127091]
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rna m6a修饰表达谱检测——arraystar表观转录组芯片
不仅能在转录本水平上对m6a修饰进行定量，还能检测每个转录本修饰亚群和非修饰亚群的百分比
（1）mrna&lncrna 表观转录组芯片：适用于mrna、lncrna、pre-mirna, pri-mirna, snorna, 和 snrna；total rna要求量可低至1ug。
（2）circrna 表观转录组芯片：适用于circrna m6a检测；total rna要求量可低至3ug。
lncrna m6a 甲基化pcr验证：
（1）转录本水平验证lncrna 的m6a 修饰：m6a抗体富集发生m6a修饰rna（rna不作片段化处理） lncrna转录本特异性pcr检测
（2）基于mazf 酶处理的lncrna m6aca位点检测：lncrna m6aca位点预测 mazf酶处理 m6aca位点pcr检测
circrna m6a 甲基化pcr验证：
（1）环状rna m6a 修饰验证：m6a抗体富集发生m6a修饰的rna rnase rna消化线性rna，保留circrna circrna反向接合位点设计引物
（2）基于mazf 酶处理的circrna m6aca位点检测：circrna m6aca位点预测 rnase r去线性rna mazf酶处理 m6aca位点pcr检测
