客户成果丨pre-mir-320/runx2的m6a修饰调控骨髓来源间充质干细胞的成骨潜力

——arraystar表观转录组芯片客户成果——

pre-mir-320/runx2的m6a修饰调控骨髓来源间质干细胞的成骨潜力


作者单位:哈尔滨医科大学附属第一医院、哈尔滨医科大学附属第二医院、哈尔滨医科大学


研究团队利用arraystar mouse mrna&lncrna表观转录组芯片发现runx2与pre-mir-320的m6a修饰受到mettl3的调控。在骨质疏松临床病例与小鼠模型中和间充质干细胞(bmscs)分化为成骨细胞前,mettl3显著下调。小鼠体内实验证实,过表达mettl3,可以增加骨质,促进骨的形成。机制研究发现,mettl3通过调控骨髓来源的间充质干细胞(bmscs)中的m6a修饰水平,诱导成骨细胞分化,促进骨的形成。该研究成果发表在学术期刊molecular therapy nucleic acids上(if:5.91)(芯片实验由康成生物丨数谱生物提供技术服务)。


研究背景:

m6a修饰是mrna和ncrna中丰度最高的化学修饰,m6a转移酶复合体的主要成分有mettl3、mettl14和wtap等,去甲基化酶包括fto和alkbh5。并且在多种疾病中都已发现m6a相关酶可以调控疾病的发生发展,m6a修饰本身也可以调控rna稳定性、rna结合蛋白、翻译、rna核质分配等多种过程。

如今,在基础研究与临床应用领域,干细胞疗法已有极大的进展,尤其是骨髓来源的间充质干细胞(bmscs)疗法已有多篇文章报道,bmscs可以分化成骨细胞,调控骨代谢平衡。因此研究m6a修饰是否能影响骨分化相关基因的稳定性与翻译效率具有极大意义。

研究思路:

文章着重于研究m6a修饰及m6a修饰转移酶mettl3在骨质疏松和bmscs分化成骨细胞中的功能与机制,运用arraystar mouse mrna&lncrna表观转录组芯片检测在敲低mettl3的bmscs细胞中,显著差异的m6a修饰百分比的指标。通过差异倍数(fc值)>1.2进行筛选后,挑选了pre-mir-320与runx2进行merip-pcr验证。

首先,为了证明m6a修饰在骨质疏松进展过程中具有研究意义,作者发现骨质疏松临床样本与小鼠模型中,m6a修饰的整体水平与甲基转移酶复合体蛋白mettl3与mettl14显著下调。在骨质疏松模型中过表达mettl3,可以显著增加骨密度、骨小梁数目、骨小梁厚度和平均骨体积。在bmscs中过表达mettl3可以促进bmscs向成骨细胞的分化;敲低mettl3则抑制bmscs的分化,证明mettl3在骨形成过程中发挥重要作用。

而后,为了研究mettl3调控bmscs分化为成骨细胞的作用机制,作者构建了mettl3敲低的bsmcs细胞系,进行了m6a修饰转录本的高通量筛选。经过merip-pcr与qpcr验证发现runx2和pre-mir-320的m6a修饰水平产生差异,并且调控了runx2与pre-mir-320的稳定性,降低了bmscs的成骨分化能力。序列分析发现mmu-mir-320可以靶向runx2 mrna,促进runx2的降解。因此mettl3可以通过上调pre-mir-320的m6a修饰促进pre-mir-320的降解,下调成熟体mmu-mir-320的丰度,从而导致runx2上调;也可以直接调控runx2的m6a甲基化修饰,促进runx2的稳定性,从而影响bmscs细胞的分化能力。

技术路线:


结果展示:

图1. 骨质疏松病人中m6a修饰和mettl3表达量降低。a. 骨质疏松病人中m6a修饰水平降低;b. m6a修饰水平统计图;c. 骨质疏松病人中mettl3表达量下调;d. 骨质疏松病人中mettl14表达量下调。

图2. 体内过表达/敲低mettl3影响骨形成。a. 过表达mettl3促进骨形成;b. 敲低mettl3抑制骨质疏松模型小鼠的骨形成。

图3. 敲低mettl3进行m6a修饰的高通量筛选。a. 鉴定mettl3靶基因的高通量筛选流程图;b. 高通量筛选数据分析方式;c. 差异修饰的基因散点图。

图4. runx2的差异表达同时受mir-320与mettl3的调控。a. merip-pcr证明pre-mir-320发生m6a修饰;b. 过表达mettl3降低pre-mir-320的稳定性;c. merip-pcr证明runx2发生m6a修饰;d. 过表达mettl3促进runx2的稳定性;e. 敲低ythdf1降低runx2的稳定性;f. 过表达mir-320降低runx2的表达量。

研究意义:

本研究利用arraystar mouse mrna&lncrna表观转录组学芯片研究m6a修饰在骨髓间质干细胞(bmscs)分化为成骨细胞中的功能与机制,证实了调控bmscs中m6a修饰程度可以促进bmscs的分化能力。相比于正常组织,骨质疏松病人与小鼠模型中,m6a修饰与mettl3的表达量都处于下调的状态。过表达mettl3可以促进小鼠骨骼的形成;敲低mettl3,抑制bmscs分化成为成骨细胞的相关基因的表达。merip等实验证实mettl3可以通过调控pre-mir-320和runx2的m6a修饰调控runx2的丰度。一方面,m6a修饰促进pre-mir-320的降解,使得mir-320丰度降低,促进runx2的表达;另一方面,runx2的m6a修饰可以促进runx2的稳定性,最终影响bmscs的分化。


原文出处:


康成生物丨数谱生物国内独家提供arraystar表观转录组芯片技术服务

· 覆盖编码基因和非编码基因的表观转录组

(1)mrna&lncrna 表观转录组芯片:适用于mrna、lncrna、pre-mirna, pri-mirna, snorna, 和 snrna;

(2)circrna 表观转录组芯片:适用于环状rna m6a检测

· 准确定量转录本修饰百分比:双通道芯片不仅能对m6a修饰进行定量,还能检测每个转录本修饰亚群和非修饰亚群的百分比

· 转录本特异性检测:使用外显子和跨剪接位点特异性探针

· rna起始量低至1ug,适用于各类样本