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蛋白相对定量 tmt标记定量技术 非标定量技术 |
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rna/蛋白-蛋白相互作用 rna-蛋白相互作用 蛋白-蛋白相互作用 |
美国威斯康星大学（麦迪逊分校）raghu vemuganti教授长期从事ncrna及脑损伤相关研究。近期，其实验室利用arraystar mouse表观转录组芯片 ，首次发现在小鼠短暂局部性缺血12小时并再灌注后，122个mrna和17个lncrna的m6a修饰水平上升，15个mrna和3个lncrna的m6a修饰水平下降。通过go/pathway分析发现m6a修饰水平变化的mrna显著富集到炎症、细胞凋亡和转录调控等生物学过程。m6a修饰水平的变化可能是由去甲基化酶fto表达下调引起。该研究成果于2019年8月发表在stroke （if: 6.046）。
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研究背景
缺血性脑卒中后神经元的命运由一系列复杂的生化和分子事件决定，包括兴奋性毒性、离子失衡、氧化应激、内质网应激、细胞凋亡和炎症等。缺血敏感性转录组的迅速改变可以促进这些过程的发生。此外，rna的转录后水平调控可以精细调节缺血后病理生理变化，如非编码rna、rna结合蛋白和表观转录后修饰等。最近的研究表明，rna上存在一百多种不同的化学修饰，可以在转录后水平调控rna，其中m6a是含量最丰富的化学修饰，可以调控mrna的剪接、运输、定位、翻译和降解。在哺乳动物细胞中，甲基转移酶mettl3、mettl14和wtap催化m6a修饰的形成。而去甲基化酶fto和alkbh5介导去甲基化。而且fto在脑中高度富集，其缺失导致多巴胺能神经元神经传递受损和先天性小头畸形。近期研究表明心肌缺血可导致控制心肌细胞收缩功能mrna的m6a修饰水平上升。m6a修饰在哺乳动物脑中丰度最高，可以调控突触可塑性、轴突生长、学习记忆和应激反应。但m6a修饰缺血性脑损伤中的作用尚不清楚，为此文章作者检测了短暂局部性脑缺血对mrna和lncrna上m6a修饰的影响。
技术路线
结果展示
1. 预实验：dot blot证明短暂局部性缺血后m6a修饰总体水平升高。
为探究小鼠大脑短暂局部性缺血后，m6a修饰总体水平的变化，作者分别选取缺血3h、6h、12h和24h时雄性小鼠和对照小鼠大脑进行dot blot实验，发现12h和24h时，m6a水平明显上升。在雌性小鼠中，短暂缺血24h时，m6a水平显著上升。
图1. 小鼠大脑短暂局部缺血后m6a水平明显上升（雄性：12h和24h时，雌性：24h时）。
2.高通量筛选：arraystar mouse 表观转录组芯片证明短暂局部性缺血后显著改变特定rna的m6a修饰水平。
确定短暂局部性缺血可导致rna m6a总体水平显著升高后，作者利用merip和arraystar 表观转录组芯片，检测了短暂局部性缺血12h时小鼠大脑中mrna和lncrna的m6a修饰水平。芯片共检测到44122个mrna转录本和12496个lncrna转录本，其中127个mrna和20个lncrna的m6a水平发生显著变化。其中95% rna（122个mrna，17个lncrna）的m6a修饰水平明显上升，只有5% rna（5个mrna，3个lncrna）的m6a修饰水平下降。然后作者选取6个mrna和2个lncrna 分子，利用merip-qpcr检测了m6a修饰水平的变化，结果与arraystar表观转录组芯片结果相符。
图2. 短暂局部缺血后m6a修饰水平上升的mrna及lncrna明显多于修饰水平下降的rna。
图3. 利用merip-qpcr验证4个m6a修饰上升的rna（a）和4个m6a修饰下降的rna（b）。m6a的reader蛋白ythdf1和ythdf3在短暂缺血24h时表达上升（c）。
3.生信分析：m6a修饰发生明显变化的rna显著富集到炎症、细胞凋亡和转录调控等生物学过程。
为确定m6a修饰发生明显变化的mrna的功能，作者进行了go/pathway分析，发现相关mrna显著富集到炎症、细胞凋亡和转录调控等生物学过程，细胞因子活性、蛋白酶结合、转录激活因子和转录抑制因子活性等分子功能，以及gpcr信号、细胞因子信号、肿瘤坏死因子（tnf）信号等kegg通路，已有研究表明这些通路可以调控缺血性脑损伤。m6a修饰水平的变化可能影响了mrna的翻译和lncrna的功能，进而影响了脑缺血后细胞的命运。
图4. 对m6a修饰发生显著变化rna的go/pathway分析结果。
4.mrna qpcr/wb：去甲基化酶fto在短暂缺血后表达下调。
为确定m6a修饰水平上升的原因，作者分别检测了短暂缺血后m6a writer、reader和eraser的表达量，发现reader基因ythdf1和ythdf3只在缺血24h时表达上升，writer基因mettl3、mettl14和 wtap的表达量不变，eraser基因fto表达显著下降。免疫染色实验表明fto主要在神经元中表达。说明m6a修饰水平的升高可能是由去甲基化酶fto表达下调引起。
图5. 短暂缺血后fto的mrna（a）和蛋白(b)表达以及酶活性(c)均下降。
图6. fto主要在神经元中表达。neun 是神经元细胞标志性蛋白，gfap 是星形胶质细胞标志性蛋白，iba1 是小胶质细胞标志性蛋白。
研究意义
该课题组借助arraystar表观转录组芯片检测了小鼠短暂局部性脑缺血后mrna和lncrna上m6a修饰水平的变化。发现m6a修饰发生变化的rna中大多数是修饰水平上升的，这些rna显著富集到炎症、细胞凋亡和转录调控等生物学过程。m6a修饰水平的变化可能是由去甲基化酶fto表达下调引起。该研究首次表明小鼠脑卒中明显改变rna的m6a修饰水平，这可能对脑卒中后的病理生理学变化具有重要影响。
文章出处
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