antisense lncrna的调控作用

      天然反义转录物(natural antisense transcripts, nats)是在自然情况下生物体内产生的内源性rna,它们与对应的互补rna通过碱基配对,形成自然正义—反义转录物配对的双链rna,对器官形成、细胞分化和疾病发生等各种生理和病理过程都有重要的调控作用。研究发现,nats不是某一特定种类,而是具有一些共同特征、分属不同种类的rna。

      nats在哺乳动物基因组内广泛存在,并且大部分转录单位(tus)都包含nats。与此同时,研究还发现nats具有多个活性启动子,这就证明了nats在哺乳动物基因组内广泛存在的原因。如fantom3数据库报道,小鼠转录组中70%的转录单位含有nats,并且这些转录物绝大部分是非蛋白编码rna。

      目前研究证明,不论是正义还是反义rna均可编码蛋白或形成非蛋白编码rna;但在哺乳动物体内,nats主要以反义非蛋白编码rna(antisense lncrna)形式存在。antisense lncrna的存在给我们以提示: antisense lncrna可能会调节蛋白编码的正义rna。antisense lncrna通常在转录水平和转录后水平对基因进行调控。

      本文就antisense lncrna的调控作用作如下综述。

 

反义rna的特点

      antisense lncrna在基因组中分布极不均匀。antisense lncrna常常位于蛋白编码基因两端,如antisense lncrna在转录起始位点上游250个核苷酸和基因有义链下游富集。由于antisense lncrna很少经历剪接事件,从而导致与正义转录物相比富集程度低。在不同组织和细胞系中,正义和反义转录本的表达水平可以呈正相关也可以呈负相关。此外,研究还发现,人细胞系antisense lncrna的表达水平往往与正义基因的表达有关;同时,将内源的antisense lncrna进行基因敲除后会出现相应正义转录物出现或升或降的变化;这就表明antisense lncrna会在转录水平对正义转录物进行调节。

      antisense lncrna的特性预示它们在调控基因表达时存在一系列的调控机制。关于反义转录rna调控正义mrna有许多假设机制。在此,我们将其归为四类进行讨论:转录水平的调节、rna-dna相互作用、rna-rna核内相互作用以及rna-rna胞质相互作用。

 

转录水平的调节

      antisense lncrna行使这种调控机制,是因为其转录方向与正义rna转录方向相反,而不是antisense lncrna本身的调节功能引起的。antisense lncrna在转录过程中可能会引起正义rna的改变;下面就转录碰撞和基因重组两种模型予以分析(图1)。

 

转录碰撞

      在同时转录正义rna和antisense lncrna的过程中,两个rna聚合酶分别于正-反义基因的启动子区域结合,开始合成rna,并向各自的3’段移动,这样两个rna聚合酶在两者之间的重叠区域相遇时,即开始转录碰撞,从而抑制它们的转录过程(图1a)。运用原子力显微技术,这种假设的模型已在escherichia coli,saccharomyces cerevisiae中得到证实。在人和小鼠的基因组转录时,转录碰撞可能是antisense lncrna调控正义转录物的普遍机制;但是总的来说,有确凿数据支持的转录碰撞的实例非常少。而且,antisense lncrna 与其正义基因的转录可能在时间上( 不同生长或发育阶段) 或空间上( 不同染色体) 根本就不可能相遇。这种模型证明了反义rna是由于与正义rna转录方向不同而影响正义rna的合成。但如上所述,正义和反义rna经常在不同时间、不同染色体上进行转录,所以这种调控模型并不是antisense lncrna调控基因表达的主要形式。


图1.转录水平调节模式图

 

基因重组

      为了适应和应答外界环境的各种刺激,b和t淋巴细胞成熟过程中,在免疫球蛋白和t细胞受体基因的可变区经常发生体细胞超突变(shm ) 或类型转换重组(csr) ,以提高抗体对抗原的亲和力,从而产生不同的生理效应;这个过程是转录依赖性的。免疫球蛋白可变区基因的反义转录能够使局部的模板dna 解链变为单链dna,释放出空间便于激活诱导胞嘧啶核苷脱氨酶(aid) 靠近单链dna,使胞嘧啶脱氨变为脱氧尿嘧啶( du )(图1b)。这一步碱基修饰对体细胞超突变是非常重要的。而目前研究表明在可变区的反义转录使得aid可以靠近单链dna 。在此模型中,反义转录打开dna双链形成单链形式,起始aid酶进行的调控,在此过程中会改变染色质结构从而使dna序列易于重组。在这两中模型中,起作用的是反义转录过程本身,而不是由其产生的antisense lncrna的调控作用。

 

rna-dna的相互作用

      antisense lncrna也可能会通过表观遗传调控发挥功能,这种调控基于直接或间接的rna-dna或rna-染色质相互作用。antisense lncrna可能会结合到相应的dna链上产生dna甲基化(图2a)或者通过招募组蛋白修饰酶(hme)改变染色质的状态(图2b)。与dicer酶作用机制不同,antisense lncrna会在局部聚集,从而对dna或染色质进行修饰;这些修饰继而影响到上述修饰区域的相邻区域,这种第二次修饰可能仅仅限于一个基因的启动子或增强子,但不断地发展下去最终会影响到整条染色体,如女性中x染色体的失活。


图2.天然antisense lncrna引起染色质和dna表观遗传的变化

 

修饰dna或染色质

      antisense lncrna可能会引起dna甲基化、dna去甲基化和常染色体基因座非印记修饰等。编码正义rna的dna启动子区域发生dna或染色质修饰往往会抑制转录;例如一种antisense lncrna会引起α-血清球蛋白基因(hba2)甲基化,从而导致hba2基因沉默。

      antisense lncrna也会通过dna甲基化或形成异染色质,从而影响到编码p15,p21和孕酮受体(pr)的基因产生转录水平的沉默。有义链启动子区域组蛋白h3的第27个氨基酸上三甲基化(h3k27me3)往往抑制正义转录。如cdkn1a(一种抑癌基因)的antisense lncrna通过招募调节复合物诱导h3k27me3,从而抑制有义启动子活性。由于一个细胞特定基因只有两个dna拷贝,因此,每个细胞内两个antisense lncrna足以结合到相应dna链行使调控功能。

 

启动子活性与染色质重塑

      重叠转录区小rna(<50nt)、启动子相关小rna(pasrs)、终止子相关小rna(tasrs)、启动子上游转录物(prpmpts)以及转录起始位点相关rna(tssa-rnas)已在人类基因组中报道。相对于蛋白编码基因往3’端转录,tssa-rnas会在活性启动子两侧均有转录。这种异常启动子活性已有充分文献证实,并且在50%以上小鼠和人类基因组均有发现。启动子的这种活性是对传统基因认识的一种挑战,异常的启动子活性暗示了基因不再有明确的5’和 3’端界限的存在。

      prompts和tssa-rnas的转录区域与rna聚合酶ⅱ以及活性染色质重叠,研究表明这种局部rna的聚集会维持染色质状态,从而有利于启动子的活性。转录起始和终止位点短链rna以及上游基因的转录往往与活性染色质共定位,预示着这些rna转录物不仅会调控正义转录物,还会参与染色体的重塑。

 

基因组印记

      在大多数情况下,亲本源的基因均等表达;但在印记基因中,仅特异地表达父源或母源的等位基因。研究发现,antisense lncrna往往与基因印记有关,两者之间的相关度在81%以上。如父源表达的胰岛素样生长因子受体2反义rna(airn) 通过重叠igf2r 启动子区域抑制rna 聚合酶ⅱ的募集,最终抑制胰岛素样生长因子2型受体(igf2r)的表达。目前已在人类和小鼠中发现160余种印记基因。

 

x染色体失活

      x 染色体失活过程是指雌性哺乳动物中的两条x 染色体中的一条随机失活,以达到雄性和雌性中表达等量的x 关联基因。来自x 染色体失活中心的两个长链非蛋白编码基因,即x 染色体特异性失活转录物(xist) 和xist 的antisense lncrna(tsix) 共同控制着x 染色体的失活。xist 的表达只来源于失活的x 染色体,通过结合prc2 复合物,以催化形成h3k27me3,并使prc2 复合物作用于x 染色体,改变染色质状态,从而抑制基因的转录。tsix通过对xist启动子区域的染色质结构进行修饰,抑制xist 的活性,与后者共同调控x 染色体失活过程。

 

rna-rna核内相互作用

      这种机制基于核内反义和正义rna会形成二聚体(图3aa)。rna二聚体的形成会对正义mrna的表达产生重要影响。核内rna二聚体的形成会封闭剪接位点,影响mrna 前体的剪接过程,产生不同的mrna 成熟体。

 

选择性剪接

      antisense lncrna与正义rna结合形成二聚体会封闭剪接位点,从而改变不同剪接体之间的平衡(图3ab)。例如甲状腺激素受体有trα1 和trα2 两种可变剪接体,二者在细胞内的表达水平保持一定比例,功能上是拮抗的。trα2 的反义链表达antisense lncrna reverbaα,对trα2 5’剪接位点的活性有影响,可导致trα2 的mrna 水平下调,改变与trα1 的比例,调节甲状腺激素受体在不同组织或生理条件下的功能状。此外,antisense lncrna还会通过类似途径引起聚腺苷酸化影响基因的转录。

 

mrna的运输与antisense lncrna核滞留

      反义和正义rna二聚体的形成会影响到mrna的核运输;此外,核内蛋白质或其他rnas的相互作用会引起antisense lncrna在核内滞留,然而目前尚不明确其中的机制。antisense lncrna主要存在与细胞核内行使调节功能,诸如低氧、血清饥饿、过氧化物等细胞压力因子的存在会改变核内antisense lncrna的存在模式,从而改变相应正义rna的水平。

 

mrna的编辑

      antisense lncrna还会影响到mrna编辑(图3ac),如黑腹果蝇中的一个基因rnp4f与其反义转录本sas10,在它们的重叠区会对rnp4f的mrna进行腺苷脱氨基至肌苷的转换。果蝇的sas-10 是rnp4f 基因的antisense lncrna,二者形成双链rna,在adar 的作用下使4f-rnp 的部分腺嘌呤转换为次黄嘌呤,并且导致4f-rnp mrna 水平的降低。


图3.核内和胞质中正义-反义rna相互配对形成二聚体

 

rna-rna胞质相互作用

      这种机制是基于反义rna和正义rna在胞质内形成二聚体(如图3ba-c),形成的发夹结构会影响正义mrna的稳定性和翻译;或者,该二聚体可能会封闭mirna结合位点;或这,作为发夹模板产生内源性sirnas。

 

影响mrna的稳定性和翻译

      在胞浆中,antisense lncrna 通过与正义链mrna 结合形成双链而影响后者的稳定性和翻译效率。两者的结合区域通过降低mrna衰退、影响mrna的稳定性;或者,mrna此区域通过多种rnases进行一系列内外源核苷酸的剪切而降解。如β位点淀粉样蛋白前体裂解酶1(bace1) 基因的antisense lncrna bace1-as 与bace1 第6 外显子完全重叠,二者形成二聚体可能改变了bace1的次级或三级结构,从而增强了bace1 mrna的稳定性。

      当生物体遭受内外毒素、炎症反应等刺激时,诱导型一氧化氮合成酶(inos) 会被大量合成,以产生足量的一氧化氮发挥多种调节作用。inos 基因的天然antisense lncrna通过与人抗原hur 相互作用,能够使inos mrna 免受核酸酶攻击,从而增强其稳定性,保证一氧化氮合酶的产生能满足细胞代谢的需要。hif1αantisense lncrna αhif 可以与其3′utr 的序列结合,改变局部二级结构,使are 元件暴露,hif1αmrna 在核酸酶的作用下降解。

      antisense lncrna还会抑制翻译,如b细胞成熟抗原(bcma)基因的antisense lncrna抑制bcma 翻译,却不会造成bcma mrna 水平的变化; 显然它是在翻译水平调控bcma 的表达。另一个显著的例子是:转录因子pu. 1 的反义rna 分子可以在翻译的起始和延伸之间抑制翻译的进行,形成的二聚体会影响与核糖体的结合,从而下调pu. 1 的表达,但对pu. 1 的mrna 水平没有影响。

 

封闭mirna结合位点

      antisense lncrna与其相应正义rna形成的二聚体会封闭mirna 的结合位点来维持正义转录物的稳定性。以bace1为例,其antisense lncrna不仅会增强bace1 mrna的稳定性(如前文),还会通过覆盖bace1 mrna 的mirna 结合位点以阻止mirna介导的翻译抑制。fantom3数据库报道,至少34%的天然antisense lncrna与正义mrna 3’utr区域可能形成二聚体;而mrna 3’utr区域往往含有mirna作用的靶位点,所以天然antisense lncrna会与mirna竞争结合3’utr同一区域,以维持mrna的稳定性。

 

内源sirna的形成

      antisense lncrna与其正义rna形成的双链rna,很可能会在dicer 的加工下产生内源性sirna,从而调控基因表达。如在拟南芥中发现一些蛋白编码基因及其反义rna 可生成内源性sirna,通过选择性的降解p5cdh mrna,使细胞内的脯氨酸水平升高以增强拟南芥的抗盐碱。而且,拟南芥中64%以上的蛋白编码基因可以与相应的antisense lncrna结合会生成内源sirna。

      类似的发现还有,在x 染色体失活过程中,tsix 与xist 形成双链,并倾向形成sirna;在小鼠卵母细胞中,也发现antisense lncrna形成内源性sirna。该发现,从另一个方面诠释了antisense lncrna在转录后水平的调控作用及其与其它rna 之间的相互关系。

 

结语

      前文中,我们就antisense lncrna调节基因表达的功能机制提出了四种模型,并且每种模型都列举了详尽的例子予以阐述。在这四种模型中,如上文所述,转录碰撞模型是不常见的一种调控机制;核内和胞质rna-rna之间的相互作用会产生如rna编辑、剪接等结果,但也不是antisense lncrna的主要调控方式。此外,在rna与dna相互作用模型中,antisense lncrna引起dna甲基化缺乏大量文献的报道,这种调节可能仅仅发生在一些特定的发育阶段。相反,反义rna引起的染色体重组可能是许多低拷贝antisense lncrna调控的最主要机制;在这种模型中,反义rna修饰染色体结构,最终抑制有义基因的表达。尽管目前研究表明天然antisense lncrna参与多种基因调控通路,但其具体的分子特性目前尚不明确。

      虽然目前对天然antisense lncrna产生及作用的机制并不完全清楚,但可以肯定的是:它的调控作用在人类基因组中无处不在。目前已有很多研究证实antisense lncrna对生物的生长发育和疾病的产生发展有重要的调控作用。如扰乱这些antisense lncrna的产生,则会扰乱正义rna的正常表达,从而对机体生长发育及疾病等产生影响。深入挖掘这些antisense lncrna的调控机制必将为相关疾病的临床治疗带了新的突破口,为人类身体健康带来新的福祉。