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蛋白相对定量 tmt标记定量技术 非标定量技术 |
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超级增强子lncrna（se-lncrna）一般具有稳定性差、半衰期短的特点。它们能以极低的拷贝数发挥顺式作用，激活靶基因的表达。比如，se-lncrna hottip可激活hoxa基因簇，其在细胞中的平均拷贝数少于1。
为了精确地检测这些瞬时、低水平的se-lncrna，arraystar科学家开发了一套高效的线性扩增方法，能够为多聚腺苷化或非多聚腺苷化的转录本产生足量的荧光标记crna。在此过程中，将分别携带有t7聚合酶启动子序列的oligo(dt)和随机引物以优化后的比例进行混合，作为反转引物合成cdna第一链，随后进行双链cdna合成与pcr扩增。最后，由t7 rna聚合酶进行体外转录，合成带有cy3或cy5标记的crna（下图）。
该标记方法极大的增加了低丰度或降解rna分子的crna产物，比传统方法提高了100多倍。
图释：arraystar公司se-lncrna芯片crna标记流程。(1) cdna第一链合成与5’接头退火。 以携带有t7聚合酶启动子序列的oligo(dt)和随机引物混合物为反转引物，合成cdna第一链，并与5’接头退火，合成cdna第二链。(2) pcr扩增。使用rt引物和5’接头序列对双链cdna进行低循环数的pcr扩增。(3)体外转录和标记反义rna (arna)。以cy3或cy5标记的核苷酸为底物，双链cdna为模板，使用t7 rna聚合酶进行体外转录，合成带有荧光标记的反义rna。线性扩增保留了原始转录本的相对水平和完整序列，且无3’偏好性。
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