客户成果丨lncrna jpx通过cerna机制调控肺癌的发生发展和转移-凯发app

客户成果丨lncrna jpx通过cerna机制调控肺癌的发生发展和转移

宁波大学医学院龚朝辉教授团队主要从事肿瘤分子生物学研究。今年，该研究团队应用arraystar lncrna芯片筛选发现了一个在肺癌中异常上调的lncrna——jpx，该lncrna分子通过与mir-33a-5p结合而充当twist1的cerna，影响肿瘤的大小、tnm分期和肺癌的转移。进一步深入研究表明，jpx是通过调节mir-33a-5p/twist1，参与了wnt/β-catenin信号的激活，进而促进了emt过程，最终影响了肺癌的发生发展。该研究提示jpx/mir-33a-5p/twist1轴可能具有治疗肺癌的潜力，具有作为药物作用靶点的潜力。该研究成果发表在molecular cancer上(if：15.302)上。（芯片实验由康成生物丨数谱生物提供技术服务）

研究背景

肺癌是最恶性的癌症之一，其5年生存率根据阶段和地区差异在4％至17％之间变化。尽管近年来在肺癌的诊断和治疗方面已经取得了许多进展，但是晚期肺癌的转移仍然是导致高死亡率的主要原因。因此，需要阐明新的致癌途径，精确靶向治疗肺癌。

长非编码rna（lncrna）是一类长于200个核苷酸的rna分子，对癌症的发生、发展有重要影响。异常表达的lncrna与各种类型的癌症的发生和发展有关，在lncrna-mirna-mrna调控网络中，lncrna充当特定mrna的竞争性内源rna（cerna），调节靶基因，影响基因表达。然而，肺癌中异常表达的lncrna的功能和机制尚不清楚。

twist1是一种重要的转录因子，可介导上皮-间质转化（emt）进展和肿瘤转移。此外，wnt/β-catenin信号传导是emt和癌症转移的关键驱动因素。作者以前的研究表明，mir-33a-5p负调控twist1，从而抑制了非小细胞肺癌（nsclc）的侵袭和转移，mir-33a-5p可以作为早期肺癌诊断的潜在生物标志物。

因此，作者考虑lncrna是否可以与mir-33a-5p和twist1形成cerna网络以参与肺癌的emts和恶性发展过程。

技术路线

研究思路

lncrna高通量筛选及pcr验证

为了筛选到影响肺癌患者疾病进程的lncrna分子，作者选择了4对人类肺癌组织和癌旁组织样本，应用arraystar human lncrna芯片筛选差异表达的lncrna，共筛选出1551个差异表达的lncrna，其中817个lncrna表达上调，734个lncrna表达下调（图1a）。

接下来，使用mirna-lncrna相互作用数据库starbase预测可能与mir-33a-5p相互作用的lncrna。结果显示61个lncrna存在mir-33a-5p结合位点。这61个lncrna与1551个差异表达的lncrna取交集后发现，lncrna jpx既在肿瘤样本中表达量出现异常升高，又通过互补碱基对的七个连续配对与mir-33a-5p相互作用（图1b）。

rt-qpcr检测116对肺癌组织和癌旁组织中的jpx表达量，结果显示肺癌组织中的jpx表达明显高于癌旁组织（图1c）。回归分析表明，116例肺癌患者中，jpx的表达与肿瘤大小和tnm分期密切相关（图1d）。

图1. arraystar human lncrna芯片筛选结果及验证

a. 四对肺癌组织和癌旁组织的差异表达的lncrna。

b. 红色表示肺癌中表达量上调的lncrna，绿色表示表达量下调的lncrna。蓝色表示starbase数据库预测可能和mir-33a-5p有结合的lncrna数据集。结果的重叠处为lncrna jpx。

c. rt-qpcr检测到116个配对的肺癌相对于癌旁组织jpx相对表达量上调。

d. rt-qpcr分析四种肺癌细胞系（spc-a-1，ltep-a-2，a549，nci-h1299）相对正常肺上皮细胞系（beas-2b）中jpx相对表达量上调

功能研究

为了研究jpx的生物学功能，使用重组质粒提高jpx在肺癌细胞系中表达，使用sirna特异性敲低jpx在肺癌细胞系中表达。结果表明，jpx体外过表达促进了肺癌细胞的生长和增殖（图2a，2b，2c），而jpx敲低则抑制了肺癌细胞的生长和增殖。另一方面，利用伤口愈合实验和transwell分析实验，检测jpx对肺癌细胞迁移和侵袭的影响。结果表明，jpx小鼠体内过表达可以增强肺癌细胞的迁移和侵袭（图2d），而jpx敲低则抑制了肺癌细胞的迁移和侵袭。

图2. jpx体外过表达促进肺癌细胞的生长和增殖，增强肺癌细胞的迁移和侵袭能力

a. 进行cck-8检测，分析jpx过表达后肺癌细胞的生存力增强。

b. 集落形成分析法检测jpx过表达后肺癌细胞的增殖能力增强。

c. 裸鼠种植稳定表达jpx的nci-h1299细胞后，肿瘤生长能力增强。

d. 通过transwell法检测到jpx过表达后细胞的侵袭能力增强。

机制研究

为了揭示jpx和mir-33a-5p协同调控肺癌进程的生物学机制，首先利用核质分离实验（nuclear-cytoplasmic fractionation）得到jpx主要定位在肝癌细胞的细胞质中，进一步利用双荧光素酶报告基因实验（dual-luciferase reporters assay）、rt-qpcr、pearson相关分析，表明jpx发挥cerna调控机制，在肺癌细胞中发挥mir-33a-5p海绵的功能，通过靶向结合mir-33a-5p间接调控靶基因（图3a，3b）。体外细胞水平回补jpx的实验结果表明jpx通过调控mir-33a-5p，促进肺癌细胞增殖，迁移和侵袭的能力（图3c，3d）。

图3. jpx发挥cerna调控机制，在肺癌细胞中作为海绵，靶向结合mir-33a-5p

a. 在mir-33a-5p共转染的细胞中，突变的（mut）jpx报告质粒的相对荧光素酶活性明显高于野生型（wt）质粒。

b. rt-qpcr检测到敲除jpx后mir-33a-5p相对表达量上调。

c. 通过伤口愈合实验检测jpx过表达对mir-33a-5p介导的细胞迁移抑制的回补效应。

d. 通过transwell检测到jpx过表达对mir-33a-5p介导的细胞侵袭抑制的回补效应。

由于已知研究表明mir-33a-5p负调控其靶基因twist1，作者进一步研究jpx和twist1在肺癌中的关系。对95对肺癌组织和癌旁组织样本检测的结果表明，twist1在肺癌组织中高表达。pearson相关分析表明，在肺癌患者中，jpx表达与twist1正相关（图4a）。在肿瘤模型小鼠中，rt-qpcr显示，jpx表达在肿瘤组织中显著上调。jpx过表达诱导肿瘤组织中，twist1在rna和蛋白质层面（图4b）表达均增加。总体而言，数据表明jpx和twist1在肺癌进程中协同上调。

另一方面，已知wnt/β-catenin信号通路是emt的驱动器，通过蛋白免疫印迹研究表明，jpx通过调节mir-33a-5p/twist1，激活wnt/β-catenin信号传导，介导的emt进程（图4c，4d）。

图4. jpx/mir-33a-5p/twist1通过激活wnt/β-catenin途径促进肺癌细胞的emt进展

a. rt-qpcr检测twist1在jpx表达量高的临床样本中的相对表达量上调。

b. 蛋白免疫印迹检测到过表达jpx的spc-a-1和nci-h1299细胞系中，ecadherin，n-cadherin，vimentin，twist1，gsk-3β和β-catenin的表达量。

c. 蛋白免疫印迹检测si-ctnnb1 pcdna3.1-jpx转染后spc-a-1细胞中β-catenin，e-cadherin和n-cadherin的表达量。

d. 蛋白免疫印迹检测si-twist1 pcdna3.1-jpx转染后的spc-a-1细胞中gsk-3β和β-catenin的表达量。

总结全文，研究结果表明，jpx/mirna-33a-5p/twist1轴可作为新的cerna调控网络，通过激活wnt/β-catenin信号通路参与emt过程，从而加速了肺癌的恶性进程。这些研究结果提示，jpx可以作为潜在的治疗靶标和精准诊断和治疗肺癌的新型生物标志物。

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