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基因芯片技术服务 small rna修饰芯片 m6a单碱基分辨率芯片 mrna&lncrna表观转录组芯片 circrna表观转录组芯片 |
ngs测序技术服务 rna m6a甲基化测序（merip seq） |
lc-ms mrna碱基修饰检测 trna碱基修饰检测 |
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基因芯片技术服务 dna甲基化芯片 dna羟甲基化芯片 chip-chip |
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pcr技术服务 medip-qpcr hmedip-qpcr chip-qpcr |
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蛋白相对定量 tmt标记定量技术 非标定量技术 |
蛋白修饰 tmt标记定量磷酸化 非标定量磷酸化 |
rna/蛋白-蛋白相互作用 rna-蛋白相互作用 蛋白-蛋白相互作用 |
意大利血液治疗部门细胞再生医学实验室lorenza lazzari教授长期从事干细胞特性与治疗的相关研究。该课题组利用arraystar circrna芯片发现circfoxp1可维持间充质干细胞（mscs）的特性和分化能力。体内体外功能实验证实，敲低circfoxp1明显抑制间充质干细胞的分化。最后机制研究发现，circfoxp1与mir-17-3p/mir-127-5p相互作用，调控非经典wnt与egfr信号通路。对mscs多能性进行重编程，发现circfoxp1与非经典wnt信号通路下调，经典wnt信号通路则显著增强。意味着circfoxp1是干细胞分子网络中的重要分子。该研究成果发表在学术期刊nucleic acids research上（if:11.14）。(芯片实验由arraystar提供技术服务)
研究背景
人间充质干细胞（mscs）是能够分化成多种类型细胞的多能性干细胞，可以从成人或未出生婴儿的各种组织中分离得到，体外培养时，mscs能够进行自我更新或定向分化成中胚层组织细胞，比如骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞。因此mscs被用来治疗骨损伤等疾病，具有重要的临床应用价值。然而对于维持mscs的特性背后的分子机制仍有待深入研究。
circrna是一类将线性rna分子的3’端和5’端通过共价连接形成的环形rna分子，可以由外显子、内含子或者同时包含两种序列的片段组成。与线性分子相比，这种环形的结构可促进circrna的稳定性。circrna发挥功能的方式也有大量的研究，最主要的是一些circrna分子可作为mirna的内源性竞争吸附海绵，间接调控细胞表型。
研究思路
文章着重于研究circfoxp1在间充质干细胞的干性维持过程中的功能与机制研究，运用arraystar circrna芯片检测了成人造血干细胞、脐带血干细胞与人皮肤成纤维细胞中差异表达的circrna分子。通过p值≤0.05与差异倍数(fc值)≥1.5进行筛选后，挑选表达差异最显著的circrna分子进行pcr验证和一代测序，最终确定hsa_circ_0001320(circfoxp1)进行后续研究。
为了研究circfoxp1在mscs细胞中的功能，作者构建了circfoxp1的基因敲除细胞模型，发现间充干细胞的表面标志物在敲除circfoxp1后表达量明显降低。敲低circfoxp1，可抑制mscs向成骨细胞与脂肪细胞的分化。在大鼠股骨萎缩型骨不愈合模型中，敲低circfoxp1明显降低大鼠骨愈合程度。
为了研究circfoxp1在mscs中发挥功能的作用机制，作者通过生信预测发现circfoxp1能够吸附大量的mirna分子，通过双荧光素酶实验发现过表达mir-17-3p、mir-127-5p、mir-370-3p能明显抑制荧光素酶的表达。rna pull down实验发现在富集circfoxp1同时，也可以显著将mir-17-3p、mir-127-5p、mir-370-3p三个mirna拉下来，证明circfoxp1可直接与mirna相互作用。对这三个mirna的靶基因进行go分析后，发现其靶基因可显著富集到egfr与非经典的wnt信号通路中，最终调控mscs的干细胞特性维持。
技术路线：
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结果展示
图1、arraystar human circrna芯片高通量筛选结果及验证。a 差异circrna的聚类图；b 挑选差异表达的13个circrna 做qpcr验证。
图2、敲低circfoxp1调控mscs干细胞特性。a 核质分离检测circfoxp1主要定位在细胞质中；b 敲低circfoxp1降低mscs干细胞特性细胞表面标志物的表达；c 敲低circfoxp1，抑制mscs向成骨细胞的分化；d 敲低circfoxp1，抑制mscs向脂肪细胞的分化。
图3、circfoxp1通过结合mirna调控egfr和非经典wnt信号通路。a 双荧光素酶实验证实circfoxp1可结合mir-17-3p/mir-370-3p/mir-127-5p；b mir-17-3p/mir-370-3p/mir-127-5p靶基因go富集分析。
图4、circfoxp1调控mscs细胞特性的机制模式图。在间充质干细胞自我更新过程中，circfoxp1表达量上调，结合更多的mir12/mir127，抑制经典的wnt信号通路；在分化过程中，circfoxp1表达量下调，mir17/mir127表达量上调，靶向wnt5a，激活非经典wnt信号通路，促进mscs干细胞分化。
研究意义
本课题利用arraystar circrna芯片研究circfoxp1在间充质干细胞特性维持过程中的功能与机制，证实了circfoxp1在mscs细胞中具有重要作用。相比于分化的人皮肤成纤维细胞，造血干细胞、脐带血干细胞中circfoxp1显著上调。在敲除circfoxp1的mscs细胞中，干细胞特性相关的自我更新与分化能力都有极大程度的降低。生信分析与双荧光酶实验证实，circfoxp1可通过结合mir-17-3p/mir-127-5p间接调控egfr与非经典的wnt信号通路，维持mscs细胞的干性。
原文出处
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