客户成果|nature子刊:lncrna nkila通过增强t细胞的激活诱导细胞凋亡来促进乳腺癌免疫逃逸

中山大学孙逸仙纪念医院院长、中科科学院院士宋尔卫教授团队长期从事rna干扰在疾病中治疗应用及乳腺癌等恶性肿瘤相关研究。其研究团队利用arraystar human lncrna芯片发现lncrna nkila可与nf-κb互作抑制其激活从而调控t细胞的激活诱导细胞凋亡(aicd)敏感性,进而影响肿瘤的免疫逃逸。nkila上游受到tcr激活的钙离子流影响,进而影响钙调素及stat1与nkila启动子的结合最终促进nkila的转录。相关研究成果发表在国际著名学术期刊nature immunologyif=21.809)杂志上(芯片实验由康成生物提供技术服务)


研究背景

抗肿瘤特异性的细胞毒性t淋巴细胞(ctls)在免疫清除过程中可以杀伤肿瘤细胞,尽管如此,癌症可以利用t细胞的激活诱导细胞凋亡(aicd)进行免疫逃逸。肿瘤微环境中的fasl、trail和tnf等凋亡因子可诱导肿瘤浸润t细胞的aicd过程。由于不同的t细胞亚群在抗肿瘤过程中有不同的角色(ctls和th1抗癌,th2和treg促癌),他们对于肿瘤介导的aicd的敏感性以及他们的aicd对肿瘤免疫逃逸的贡献程度有待进一步的深入探讨。

lncrna是一类具有表达调控功能的rna分子,lncrna在肿瘤浸润t细胞相关的肿瘤免疫调控过程中的功能未知,本研究目的是探究lncrna对肿瘤浸润t细胞亚群的aicd敏感性的调控及在肿瘤免疫逃逸过程中的作用。


技术路线


研究思路

首先,作者通过研究发现肿瘤浸润t细胞不同亚群对aicd的敏感性不同。肿瘤微环境中,cd8 t细胞活化分化的ctls和cd4 t细胞活化分化的th1凋亡敏感性高,免疫抑制型的th2和treg细胞凋亡敏感性低。将肿瘤细胞裂解物致敏的树突状细胞(dendritic cell,dc抗原提呈细胞)与t细胞共培养可活化t细胞形成ctls杀伤肿瘤细胞,这些ctls包括aicd敏感型和耐受型,其中nf-κb在aicd耐受型里面表达上调,(抗原刺激激活t细胞受体tcr,进而激活iκb激酶ikk,导致iκb磷酸化、泛素化降解,将nf-κb的p50/p65二聚体从nf-κb/iκbα复合物释放并入核启动靶基因转录)nf-κb灭活可以提高t细胞的aicd敏感性。

为了研究lncrna在nf-κb调控aicd的过程中的关联性,作者利用arraystar human lncrna 芯片对肿瘤细胞裂解物致敏的dc细胞共培养6天后激活的乳腺癌浸润t细胞样本分别做了iκbα和nf-κb组分p65抗体的rip-chip,鉴定到96个两种蛋白共同结合的lncrna,作者同时利用arraystar human lncrna芯片对未激活与6天后培养激活的t细胞进行差异表达lncrna筛选,发现96个结合的lncrna中有4个(xloc_011899, rp11-854k16.3, rp11-315i20.3和nkila)也发生了显著表达上调,作者利用qrt-pcr进行的lncrna表达验证,rip-qpcr进行了iκbα和p65结合lncrna验证,与前期筛选趋势相符。

作者利用nkila rna pull down实验反向验证nkila在ctls中可以特异性富集iκbα、p65和p50,fish定位实验证明nkila、iκbα和p65可以共定位于细胞质中,这些实验提示nkila可能结合p65对nf-κb-iκbα复合物进行调控。作者也研究了nkila所受到的上游调控因素,通过chip、luciferase实验发现受抗原刺激的tcr可以激活钙离子流促进钙调素入核并去除nkila启动子的hdac(组蛋白去乙酰化酶),进而促进组蛋白乙酰化及stat1的结合,最终促进nkila的转录。

随后,作者对nkila进行了in vitro细胞水平的功能研究,用pha培养激活t细胞扩增,再用anti-cd3诱导凋亡,nkila shrna干扰后凋亡被抑制,且iκba磷酸化水平升高,nf-κb上调;利用nf-κb inhibitor jsh/sc-3060处理nkila shrna干扰后的t细胞,凋亡增加;nkila shrna也能抑制抗肿瘤特异性的ctls被anti-cd3诱导的aicd过程。in vivo小鼠实验证明,利用乳腺癌病人来源的癌细胞构建移植瘤模型,nkila敲除可以抑制t细胞的aicd过程并提高过继性细胞疗法的效果;ctls进行nkila敲除可以促进肿瘤细胞凋亡并且抑制肿瘤体积增长。

最后,作者进行了临床应用研究,在24个乳腺癌病人来源的外周血和肿瘤组织中分离不同t细胞亚群,发现nkila在肿瘤特异性ctls和th1细胞中表达显著高于th2和treg细胞;对206个乳腺癌病人进行生存分析发现,nkila高表达的肿瘤特异性ctls含量高的病人预后生存期降低,说明nkila与临床预后有相关性。


结果展示

图1 arraystar human lncrna芯片筛选肿瘤裂解物激活dc共培养的ctls中iκbα和p65结合的lncrna与t细胞激活前后差异表达lncrna交集找到nkila


图2 rip-qpcr及qpcr验证p65/iκbα结合nkila及nkila激活过程差异表达


图3 机制实验rna pull down和fish定位证明nkila结合ikba和p65及三者共定位


图4 in vitro和in vivo功能实验证明nkila通过nf-κb影响t细胞aicd及肿瘤凋亡/体积增长


图5 临床应用证明nkila在不同亚型t细胞中差异表达并影响预后生存期


研究意义

在这项研究中,研究人员通过arraystar human lncrna芯片筛选了抗肿瘤特异性ctls中结合nf-κb并在激活过程差异表达的lncrna nkila,通过功能机制实验验证肿瘤特异性ctls中nkila可以通过结合nf-κb从而影响ctls的aicd过程及影响肿瘤的免疫逃逸,nkila上游受到tcr激活的钙离子流影响,进而影响钙调素及stat1与nkila启动子的结合及nkila的转录。


原文出处

nkila lncrna promotes tumor immune evasion by sensitizing t cells to activation-induced cell death. nature immunology, 2018