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rna-seq对lncrna检测的局限性

lncrnas一般表达水平较低，且在低水平即可发挥功能，常常被高丰度的rnas所遮盖（图1a和1b）[1]。 rna-seq对于lncrna检测存在严重的局限性。

由于lncrnas丰度低和缺少全长注释信息，导致lncrnas的定量不准。

如果仅仅是定性检测一个lncrna，少量的可重复测序reads即可满足需求。然而，由于rna-seq数据过于分散而导致的poisson误差，要实现精准定量，至少需要数百个reads [2]。然而，一般lncrna的表达丰度只有mrna的十分之一不到[3]。常规rna-seq在定量检测这些低丰度lncrna分子时通常表现不佳，无法满足差异表达分析的要求[1,4]（图1c和1d）。尽管增加rna-seq测序深度可以在一定程度上改善对表达量较高的转录本的检测，如mrna，但是对低丰度的转录分子lncrna则效果不显著。即使不计成本增加测序深度（虚线曲线，将普通20m rna-seq的测序深度提高数百倍），仍有一大部分（40%）转录本不能被准确定量（图1 c）[4]。此外，rna-seq中所使用的fpkm（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads）计算方法需要lncrna转录本模型的精确长度，而很多lncrna注释目前仍缺少全长序列信息[5]。相反，lncrna芯片寡核苷酸探针以高亲和性杂交靶rna，不受其它高丰度rna的影响，即使对于低丰度lncrna，也具有高灵敏度，能够实现对其精确定量[] (图1d) 。

图1.（a）lncrna的表达中值比mrna低10倍（参考gencode数据）[3]。（b）前1%的高表达基因（比如看家基因）占据了约40%的rna-seq信号，而低表达的lncrna只有很少的信号覆盖 addin en.cite addin en.cite.data [1]。（c）在一个典型的测序深度为40 m的mrna-seq中，只有不到10%的lncrna能够被可靠定量（d）当rna水平较低时，rna-seq的定量误差变得不可接受，而芯片持续表现良好[6]。

rna-seq对剪接体覆盖度差，通常缺少跨越剪接位点的reads，难以准确检测lncrna转录本异构体

lncrna一般有多个转录本异构体，且不像mrna一样有保持连续开放阅读框的限制，因此组装更灵活和模块化[1]。不同异构体与其mrna靶基因之间存在不同的基因组位置关系和调控关系。因此，在转录本水平检测lncrna非常重要。然而，rna-seq对剪切异构体，特别是那些非主流异构体的覆盖度差且不均衡[1] （图2.a）。即便测序覆盖度达到饱和，实现转录本异构体的准确重新组装也面临内在性的挑战。由于reads较短，不能在距离较远的外显子之间建立有效关联 addin en.cite addin en.cite.data [1]，使得重新组装lncrna转录本异构体和实现定量变得十分困难 addin en.cite addin en.cite.data [7-10]。而lncrna芯片上的转录本特异性探针是根据成熟的转录本异构体模型而设计，能够精确可靠地对转录本异构体实现检测和定量（图2.b）。

图2 （a）与表达水平较高的mrna相比，低水平的lncrna不能被rna-seq的短reads充分覆盖，不足以重新组装外显子模型，也无法实现定量[1]。（b）arraystar lncrna芯片转录本特异性探针（红色）可以准确、特异性的区分和定量具有不同致癌功能的转录异构体，如bcl2l1基因的不同转录本bcl-xl, bcl-xs, 和enst412972。与之相比，基因特异性探针（紫/黄/绿色）无法区分不同转录本。箭头代表转录方向。

rna-seq数据分析缺少公共lncrna数据库，无法快速的系统性注释和分析lncrna

不像蛋白编码基因已具有成熟的参考数据库，rna-seq目前仍缺少公共的完善可靠的参考数据库，以用于原始测序数据的序列比对和注释。此外，rna-seq 的短reads 在5’末端或3’末端覆盖度不均一，且经常存在rna降解、或者逆转录过程不能完整的复制至rna 5’末端等因素，导致lncrna在5’或3’末端注释不完整[1]。

arraystar lncrna芯片基于高质量的转录组和lncrna数据库，对各种来源的lncrna进行了全面收集，包括所有权威数据库、高分文章以及通过独家自有收集流程所得到的lncrna。相比其他平台，芯片注释更丰富，更详细，更全面。

表1. lncrna芯片与rna-seq在lncrna表达谱检测上的比较

arraystar lncrna 芯片	rna-seq
高灵敏度、高精准的定量lncrnas检测，即使每个细胞中只有1个lncrna 拷贝也可被检测	大部分表达水平低的lncrna不能被准确、可靠的定量检测
天然地具备链特异性检测能力，同时检测sense和anti-sense lncrna	需要预先构建链特异性测序文库，方可进行链特异性检测
明确、特异地检测lncrna转录本异构体	检测lncrna转录本异构体灵敏度低、准确性差
arraystar lncrna芯片包含自建的高质量的lncrna数据库、系统而详细的注释以及功能分析，同时囊括全部mrna编码基因	缺乏公共的lncrna参考数据库，无法对rna-seq数据进行快速的系统性注释和分析

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参考文献

1. deveson, i.w., et al., the dimensions, dynamics, and relevance of the mammalian noncoding transcriptome. trends genet, 2017. 33(7): p. 464-478.
2. anders, s. and w. huber, differential expression analysis for sequence count data. genome biol, 2010. 11(10): p. r106.
3. derrien, t., et al., the gencode v7 catalog of human long noncoding rnas: analysis of their gene structure, evolution, and expression. genome res, 2012. 22(9): p. 1775-89.
4. labaj, p.p., et al., characterization and improvement of rna-seq precision in quantitative transcript expression profiling. bioinformatics, 2011. 27(13): p. i383-91.
5. uszczynska-ratajczak, b., et al., towards a complete map of the human long non-coding rna transcriptome. nat rev genet, 2018. 19(9): p. 535-548.
6. zhang, x., et al., maternally expressed gene 3 (meg3) noncoding ribonucleic acid: isoform structure, expression, and functions. endocrinology, 2010. 151(3): p. 939-47.
7. consortium, s.m.-i., a comprehensive assessment of rna-seq accuracy, reproducibility and information content by the sequencing quality control consortium. nat biotechnol, 2014. 32(9): p. 903-14.
8. liu, y., et al., evaluating the impact of sequencing depth on transcriptome profiling in human adipose. plos one, 2013. 8(6): p. e66883.
9. steijger, t., et al., assessment of transcript reconstruction methods for rna-seq. nat methods, 2013. 10(12): p. 1177-84.
10. baruzzo, g., et al., simulation-based comprehensive benchmarking of rna-seq aligners. nat methods, 2017. 14(2): p. 135-139.