【客户成果】外泌体circrna pde8a促进胰腺导管癌细胞侵袭

       第三军医大学西南医院李晓武教授团队长期从事肝胆外科研究,近期,其实验室对利用arraystar circrna芯片研究发现了在胰腺导管癌细胞中高表达的circ-pde8a可以通过mir-338调控macc/met/erk通路,促进癌细胞侵袭。进一步研究发现,病人血浆外泌体中circ-pde8a显著高表达,影响细胞侵袭,可作为潜在的预后不良指示生物标志物。该研究成果2018年发表在期刊cancer letters(if: 6.375)(片实由康成生物提供技术服

研究背景

       胰腺导管腺癌(pdac)是目前临床上预后最差的恶性肿瘤之一,由于侵袭性强、复发率高出于癌症相关死亡原因第6位。met 为酪氨酸跨膜受体,是上皮细胞癌中的一个经典的原癌基因,激活后影响细胞迁移、入侵、血管生成、细胞分散、emt和其他生物学过程。circrna是一种内源性的非编码rna,首尾相接形成共价环状结构。已报道circrna在多种癌症中发挥调节作用,大部分是作为mirna的吸附海绵来发挥功能。在pdac中circrna的作用机制还没有详细的报道。

       外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后,释放到细胞外基质中的一种直径约30~150nm的膜性囊泡。外泌体中包含多种蛋白、rna 、以及部分dna分子,被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液、及乳汁等体液中,通过循环系统到达其他细胞与组织,产生远程调控作用。近期有多篇文章报道外泌体中的mirna、lncrna在癌细胞侵袭或代谢过程中发挥作用,pdac外泌体中的circrna的作用值得探究。

研究思路

       为了探究外泌体中circrna的作用,作者选取pdac细胞系hs 766t与高侵袭性的hs 766t-ls提取外泌体总rna,通过arraystar human circrna array进行高通量筛选,对hs 766t-ls细胞中显著上调的9个指标进行qpcr验证,circ_pde8a
(hsa_circ_0036627)趋势相符且在pdac细胞系中过表达敲减显著影响细胞侵袭。扩大样本验证,在胰腺导管癌和癌旁样本中circ_pde8a表达差异显著(p=0.014),可以作为预后不良的biomarker。

       met是影响癌细胞侵袭的原癌基因,macc是 met上游主要调控因子,结合circrna 可以作为mirna吸附海绵的机制。通过fish、rna pull down、rip实验验证circ_pde8a通过吸附mir-338,抑制mir-338对下游靶基因macc的调控。从而上调的macc激活下游met/akt以及erk通路,促进细胞侵袭。小鼠模型中验证得到相同结果。

       电镜以及标志物cd63/cd81 wb检测pdac 细胞培养基中的外泌体,通过confocal验证pdac细胞之间可以进行外泌体摄入。hs 766t-ls中过表达circ_pde8a,验证外泌体中circ_pde8a值升高,与bxpc-3细胞共培养,bxpc-3中macc显著上调,促进met 升高。小鼠中注射过表达circ_pde8a的hs 766t细胞,显著促进裸鼠成瘤,且在血液中检测到荧光标记的外泌体。提取pdac病人血浆中外泌体,检测circ_pde8a表达,circ_pde8a升高与病人的生存时间呈负相关。提示外泌体中的circ_pde8a与pdac的进程相关,参与癌症的发生发展。


技术路线



结果展示

图一、a:circrna表达谱检测流程;b:qpcr 验证;c: 扩大样本量检测circ_pde8a在癌症样本中显著上调;d: km 曲线分析circ_pde8a与预后不良相关。

图二、e :过表达circ_pde8a促进细胞侵袭;f:rip 验证circ_pde8a与mir-338结合;g:预测mir-338与macc1结合;f:circ_pde8a 通过mir-338 促进macc1/met 表达

图三、a、b :外泌体检测;c.cofocal 观察细胞摄入外泌体;efg:小鼠中验证外泌体中circ_pde8a高表达促进癌症发生发展


图四: circ_pde8a 作用机制模式图

研究意义

该研究揭示了circ_pde8a 通过mir-338 调控macc1/met途径,影响胰腺导管癌发展;并研究了外泌体中circ_pde8a参与细胞通讯,介导受体细胞侵袭,可以作为潜在的治疗biomarker。  

原文出处

tumor-released exosomal circular rna pde8a promotes invasive growth via the mir-338/macc1/met pathway in pancreatic cancer. cancer letters, 2018.