nature子刊:揭示lncrna在emt过程中发挥的作用

        西班牙塞利维亚大学教授josé a pintor-toro长期从事生物化学与细胞生物学研究, 近期,其实验室利用arraystar lncrna芯片研究发现了在tgf-β诱导的上皮-间质细胞转化(emt)过程早期起直接调控作用的lncrna分子—lnc-spry1,tgf-β诱导直接引起lnc-spry1下调,从而引发emt过程影响细胞侵袭迁移。lnc-spry1也可与u2af65作用,影响可变剪切,从而在转录和转录后层面调控基因表达。该研究成果发表在细胞凋亡领域权威期刊cell death & differentiation(if: 8.218)。


研究背景
      上皮-间质细胞转化(emt)过程是一个基本的细胞表型转变过程。期间上皮细胞失去胞间紧密连接和与基底膜的附着极性,转化为间质细胞,获得侵袭和迁移活性。在转录层面上,tgf-β可以直接激活emt过程,导致下游通路和一系列基因表达的改变。除此之外, pre-mrna的可变剪接和lncrna的调控作用也在转录后层面上增加了调控层面的复杂性。lncrna作为重要的调控型rna分子,可以在多个层面影响emt过程。目前已有的文章只研究了tgf-β信号下游和影响细胞稳定性的lncrna,本文章的研究目的在于找到emt早期起直接调控作用的lncrna分子。


研究思路
      为了探究emt过程中直接影响早期调控的lncrna分子,本次研究应用美国arraystar mouse lncrna芯片筛选tgf-β诱导nmumg细胞系2h后差异表达的lncrna和mrna。其中435个lncrna和1090个mrna发生了显著差异变化。之后选择了表达下调的spry1临近lncrna—lnc-spry1进行研究,qpcr验证表达趋势与芯片相符。
      对该lncrna进行功能研究发现,该分子在tgf-β诱导后15min就开始下调,说明是一个早期的调控分子,敲除smad4后lnc-spry1发生显著变化,因此该lncrna分子是tgf-β-smad依赖通路的靶标基因。将该分子进行shrna敲除实验,发现间质细胞特征marker vimentin和snail1升高,上皮细胞特征marker e-cadherin降低,产生迁移和侵袭表型变化,说明lnc-spry1可以重塑细胞骨架,影响细胞迁移和侵袭。
      通过研究lnc-spry1和临近基因spry1的表达,发现两者具有表达相关性,敲除lnc-spry1后进行高通量检测和go分析,发现趋化因子和细胞因子相关基因发生显著变化。进一步进行lnc-spry1的机制研究,通过rip和rna pull down技术,发现lnc-spry1可以结合可变剪切相关蛋白u2af65,从而影响emt转化相关基因fgfr pre-mrna的可变剪切过程。


技术路线


结果展示

图一、a:tgf-β处理后芯片检测中显著变化的emt相关基因;b:tgf-β处理后芯片检测差异变化显著的lncrna分布散点图;c:tgf-β处理后芯片检测fc>2,p<0.05的lncrna分布火山图;


图二、g. lnc-spry1敲除后影响基因表达的聚类图;h. lnc-spry1敲除后进行go分析,发现富集的go条目与趋化因子、细胞因子相关。


图三、a. rna pull down联合质谱实验 lnc-spry1可结合u2af65;b. rip实验 u2af65可以结合lnc-spry1。



研究意义

      该研究揭示了lnc-spry1和tgf-β诱导的emt早期调控之间的关系。tgf-β诱导nmumg细胞直接引起lnc-spry1下调,通过tgfβ-smad通路重塑细胞骨架,影响细胞迁移侵袭。lnc-spry1可与u2af65结合,影响emt转化相关基因fgfr pre-mrna的可变剪切。从而在转录和转录后层面调控基因表达。


作者介绍

      josé a pintor-toro,博士。西班牙塞利维亚大学生物分子与再生医学中心信号转导分部教授。长期从事植物、生物化学与细胞生物学研究,科研成果先后在nature genetics,pnas,nucleic acids research, cell death & differentiation 等国际权威学术刊物上发表。


原文出处

downregulation of lnc-spry1 mediates tgf-β-induced epithelial–mesenchymal transition by transcriptional and posttranscriptional regulatory mechanisms. cell death and differentiation. 2017.